Ретикулоциты - это молодые формы эритроцитов, образовавшиеся из нормобластов после потери ими ядра (безъядерные, незрелые эритроциты), созревание которых происходит в течение 24-48 ч после выхода в периферическую кровь из костного мозга, и отражающие регенеративную способность костного мозга (т.е. эритропоэтическую активность костного мозга).

МОРФОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕТИКУЛОЦИТОВ

Ретикулоциты обычно крупнее, чем зрелые эритроциты. Цитоплазма ретикулоцитов содержит базофильную сеточку (ретикулум) в виде мелких зерен, отдельных нитей, клубочков и т.п., которая представляет собой агрегированные рибосомы и митохондрии.

По степени зрелости различают 5 видов ретикулоцитов :
(1) ретикулоциты, имеющие ядро (эритронормобласты), причем зернистость у них располагается в виде плотного венчика вокруг ядра;
(2) ретикулоциты, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде клубка или глыбки;
(3) ретикулоциты, имеющие зернистость в виде густой сети;
(4) ретикулоцитов, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде отдельных нитей;
(5) ретикулоциты, содержащие отдельные зернышки.

Запомните : в норме, по Г. А. Алексееву, почти 80% ретикулоцитов относится к IV – V группам.

В норме в периферической крови содержится 0,2 – 1% ретикулоцитов («%» - содержание ретикулоцитов от общего числа эритроцитов). Данный показатель отражает возможность выхода ретикулоцитов в периферическую кровь и их дальнейшее превращение в зрелые эритроциты (созревание), как вариант нормы, уже в периферической крови (в течение нескольких часов). (! ) При нормальном эритропоэзе большинство эритроцитов проходит стадию ретикулоцитов в костном мозге.

Увеличение ретикулоцитов их в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается :
при гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах);
при острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом);
при малярии;
при полицитемии;
при лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 - 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии);
при остром недостатке кислорода;
при метастазах опухолей в костный мозг.

Следует помнить , что в случае усиленного разрушения эритроцитов доля ретикулоцитов может превышать 50% вследствие искусственного завышения числа ретикулоцитов (как уже было отмечено ранее, доля ретикулоцитов рассчитывается в % от всех эритроцитов). В таких случаях ля оценки тяжести анемий используют «ретикулярный индекс», который рассчитывают по формуле: (% ретикулоцитов х гематокрит) / 45 х 1,85, где 45 – нормальный гематокрит, 1,85- количество суток, необходимых для поступления новых ретикулоцитов в кровь. Если индекс < 2 – говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, если > 2-3, то происходит увеличение образования эритроцитов.

Истинный ретикулоцитоз : увеличение количества ретикулоцитов в периферической крови с одновременным увеличением количества ретикулоцитов в костном мозге.

Ложный ретикулоцитоз : отсутствие повышенного количества ретикулоцитов в костном мозге при повышении их количества в периферической крови (что говорит об усилении вымывания ретикулоцитов из костного мозга в периферическую кровь).

Фактором, приводящим к увеличению значения %-ого содержания ретикулоцитов могут быть прием следующих препаратов: кортикотропин, противомалярийные лекарственные средства, жаропонижающие препараты, фуразолидона (у маленьких детей), леводопы.

Запомните : ретикулоцитоз, без соответствующей эритронормобластической реакции костного мозга, наблюдается при раздражении отдельных участков его раковыми метастазами или воспалительными очагами.

Снижение количества или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается :
при арегенераторных апластических и гипопластических анемиях;
при анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты (микроцитарно-гипохромные и мегалобластные анемии);
при талассемии;
при сидеробластной анемии;
при метастазах рака в кость;
при лучевой болезни и лучевой терапии;
при лечении цитостатиками;
при аутоиммунных заболеваниях системы кроветворения;
при заболеваниях почек;
при алкоголизме;
при рецидиве анемии Аддисона-Бирмера;
при микседеме.

Факторы, искажающие результат лабораторного исследования %-ого содержания ретикулоцитов :
неправильный выбор антикоагулянта или недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом;
длительное сдавливание руки жгутом;
прием сульфаниламидов (возможны как заниженные, так и завышенные результаты);
переливание крови незадолго до исследования;
гемолиз пробы крови.

Показания к назначению анализа на ретикулоциты :
оценка активности эритропоэза при состояниях, сопровождающихся гемолизом или кровопотерей;
ценка способности костного мозга к регенерации после цитотоксической терапии и трансплантации костного мозга;
ценка восстановления синтеза эритропоэтина после трансплантации почки;
допинговый контроль у спортсменов (прием эритропоэтина);
диагностика неэффективного гемопоэза или снижения продукции эритроцитов;
дифференциальная диагностика анемий;
детекция нарушения регенераторной способности костного мозга при дефиците железа, витаминов B12, B6, фолатов, меди и мониторинга соответствующей терапии;
оценка реакции на терапию эритропоэтином, эритросупрессорами.

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ

(1) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями .

Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

(2) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии .

Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям.

Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

(3) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора .

В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.

Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры:
ретикулоциты с низким содержанием РНК , наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией);
ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);
ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);
незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга.

Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается более 30 000 эритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Ретикулоциты - молодые эритроциты, обра­зующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов явля­ется наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выяв­ляется при специальном методе окраски - суправитальном (прижизненная), т. е. без предварительной фикса­ции клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных ретикулоцитах отличается полимор­физмом; чем клетка моложе, тем субстанция более обильная. У самых молодых ретикуло­цитов она имеет форму густого клубка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, от­дельных нитей и затем отдельных зерен. В маз­ках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цве­та - полихроматофильны, т. е. окрашены раз­ными красителями.

Определение количества ретикулоцитов про­изводится при микроскопии специально окра­шенных мазков

3.2.1 Методика окраски мазков крови на ретикулоциты по Алексееву (подсчет по Фонио)

Принцип: Метод основан на подсчете числа ретикулоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов. Готовят одновременно 2 мазка (на тромбоциты и ретикулоциты).

Реактив: рабочий раствор краски по Алексееву

Оборудование: микроскоп

Ход определения: В капилляр для определения СОЭ набирают рабочий раствор до метки 0,75 мкл, и полный капилляр крови из прокола пальца больного. Соотношение красителя к крови составляет 1:4. Смесь оставляют на 2 часа, затем делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.

Подсчет производят следующим образом: сетки ретикулоцитов окрашиваются в синий цвет. Во время подсчета эритроцитов в поле зрения считают количество ретикулоцитов. Подсчитывают 1000 эритроцитов. Результат выражают в процентах.

Нормативная величина: В крови здорового человека содержится 0,2-1,0 %

(или 2-10 даже допускается до 12 проммиль) ретикулоцитов

Клинико-диагностическое значение: Появление ретикулоцитов в периферической крови указывает на усиленную работу костного мозга и используется при оценке различных видов анемий.

Повышение количества ретикулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях

Резкий ретикулоцитоз - отмечается при гемолитической желтухе

Снижение количества ретикулоцитов при наличии анемии говорит об апластическом типе кроветворения.

По уровню ретикулоцитов в крови анемии подразделяются на:

- регенераторные (количество ретикулоцитов 0,5-5 %- это постгеморрагические анемии);

- гиперрегенераторные (количество ретикулоцитов более 5% - это гемолитические анемии);

- гипо - и арегенераторные (количество ретикулоцитов снижено или они отсутствуют, несмотря на тяжелое течение анемии- гипо - и апластические, железо- и. В 12- дефицитные анемии).

Отзывы размещенные на данном сайте являются личным мнением лиц их написавших. Не занимайтесь самолечением!

Ретикулоциты (клиническое значение и лабораторная диагностика)

(1) ретикулоциты, имеющие ядро (эритронормобласты), причем зернистость у них располагается в виде плотного венчика вокруг ядра;

(2) ретикулоциты, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде клубка или глыбки;

(3) ретикулоциты, имеющие зернистость в виде густой сети;

(4) ретикулоцитов, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде отдельных нитей;

(5) ретикулоциты, содержащие отдельные зернышки.

При гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах);

При острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом);

При лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 - 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии);

При остром недостатке кислорода;

При метастазах опухолей в костный мозг.

Аномальной формы гемоглобина;

При арегенераторных апластических и гипопластических анемиях;

При анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты (микроцитарно-гипохромные и мегалобластные анемии);

При сидеробластной анемии;

При метастазах рака в кость;

При лучевой болезни и лучевой терапии;

При лечении цитостатиками;

При аутоиммунных заболеваниях системы кроветворения;

При заболеваниях почек;

При рецидиве анемии Аддисона-Бирмера;

Неправильный выбор антикоагулянта или недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом;

Длительное сдавливание руки жгутом;

Прием сульфаниламидов (возможны как заниженные, так и завышенные результаты);

Переливание крови незадолго до исследования;

Гемолиз пробы крови.

Оценка активности эритропоэза при состояниях, сопровождающихся гемолизом или кровопотерей;

Ценка способности костного мозга к регенерации после цитотоксической терапии и трансплантации костного мозга;

Ценка восстановления синтеза эритропоэтина после трансплантации почки;

Допинговый контроль у спортсменов (прием эритропоэтина);

Детекция нарушения регенераторной способности костного мозга при дефиците железа, витаминов B12, B6, фолатов, меди и мониторинга соответствующей терапии;

Оценка реакции на терапию эритропоэтином, эритросупрессорами.

Ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией);

Ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);

Ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);

Ретикулоциты: что это, нормы для детей и взрослых, высокие и низкие, роль в огранизме

В общем анализе крови нередко можно встретить и такое обозначение клеток, как RET - ретикулоциты. В полном смысле слова клетками они не являются, поскольку не имеют ядра, ровно, как и зрелые эритроциты. Между тем, определение этих форм не входит в перечень обязательных показателей гематологического исследования. Если врачу нужно, он отдельно подчеркивает интересующие его параметры. Разумеется, людям, которым доводилось сдавать подобный анализ, хочется узнать: что это за клетки такие – ретикулоциты, и почему к ним относятся так неоднозначно.

Кто они и сколько их?

Ретикулоциты – «новоиспеченные» эритроциты, только-только покинувшие костный мозг.

Норма ретикулоцитов в периферической крови взрослого человека едва превышает 1% (по данным разных авторов от 0,8 - 1,3 до 0,2 - 2%). У детей только-только появившихся на свет нормой может быть и 10%, но по мере роста и развития малыша показатели начинают снижаться и уже к двум неделям жизни максимально приближаются к нормальным значениям взрослых людей.

Вообще, эритропоэз новорожденных – это отдельная тема: взятый анализ через 12 часов после рождения показывает заметное увеличение уровня гемоглобина (до 200 г/л), эритроцитов (до 6,0 х/л и выше) и ретикулоцитов. Такая картина крови наблюдается несколько дней, затем данные показатели начинают падать, что связано со снижением выработки эритропоэтина. Через две недели – месяц продукция эритропоэтина вновь увеличивается, что приводит к повышению уровня ретикулоцитов и эритропоэз нормализуется (у полугодовалого ребенка нормы уже мало отличаются от взрослых). В этой связи хотелось бы обратить внимание читателя на обозначение единиц измерения количества ретикулоцитов, содержание их может выражаться и в промилле, тогда цифры увеличатся в 10 раз.

Таблица: нормы ретикулоцитов по возрастам

Однако возраст «до года» включает разные, очень ответственные для организма ребенка периоды. Кроме этого, нелишним будет учесть и мнение разных авторов, рассматривающих другие варианты, где нормы у детей расписаны буквально по дням и месяцам и, следовательно, несколько отличаются от предыдущих значений. Есть заметная разница и в нормах взрослых.

Пациенту самому выбирать, которой таблице верить, хотя в разных источниках можно найти еще несколько штук, однако в сомнительных случаях не мешало бы спросить в лаборатории, каким методом производился подсчет (микроскопия или автоматический анализатор) и какие референтные значения использует данная лаборатория.

Почему их так мало и какова их роль?

Родоначальником красных кровяных телец эритроидного ряда является не содержащая гемоглобин, но еще имеющая ядро, как и положено настоящей клетке, клетка – эритробласт, которая в нормальных условиях трансформируется в базофильный эритробласт (пронормобласт, где уже намечаются первые признаки гемоглобинизации (полихроматофильная стадия).

Если с кроветворением все в порядке и условия соответствуют физиологическим, то будущий эритроцит проходит стадии пронормобласта и нормобласта (он представляет собой конечную стадию развития эритроцита, когда в нем еще присутствует ядро). При дальнейшем созревании клетки происходит инволюция ядра и следующий предшественник - полихроматофильный нормоцит, его все-таки теряет, превращаясь в молодой нормоцит, называемый ретикулоцитом. Ретикулоциты ядра уже не имеют, зато содержат гемоглобин и обладают способностью переноса кислорода и углекислого газа.

Ретикулоциты входят в число показателей общего анализа крови, однако их поиском занимаются только в тех случаях, когда возникает необходимость изучения интенсивности эритропоэза . Подсчет количества эритроцитов производится в 1000 эритроцитов и ставит своей задачей определение скорости выработки красных кровяных телец костным мозгом: при ускоренной продукции – количество ретикулоцитов повышается, при угнетении – падает вниз. Резко ускоренный эритропоэз может приводить к тому, что из костного мозга будут выходить в большем, чем нужно, количестве не только ретикулоциты, но и их предшественники – нормобласты. Однако почему же их нельзя посчитать как другие клетки, в ходе клинического анализа крови?

Они требуют отдельной окраски

После потери ядра эритроциты воспринимают только кислые красители, и световая микроскопия не обнаруживает у них никаких внутриклеточных структур, позволяющих отнести форменные элементы к молодым или зрелым видам. Однако найти ретикулоциты можно, применив специальные методы окраски. Суправитальная окраска бриллианткрезиловым синим или акридиновым оранжевым, выявляющая базофильную субстанцию - гранулярные или нитевидные образования, помогает вычленить в мазке из общей массы (1000 клеток) красных кровяных телец молодые формы – ретикулоциты.

Между тем, имея в цитоплазме свойственную ретикулоцитам сетчатую субстанцию, которая определяет название клеток (substantia reticulofilamentosa), не все они «одинаковы с лица», поэтому их разделяют на 5 групп, каждая из которых имеет свои особенности расположения базофильного вещества (БВ):

1. Ядерные ретикулоциты, получившее свое название из-за расположения БВ в виде венчика или ядра.
2. Клубкообразные клетки – БВ напоминает глыбки или клубок.
3. Полносетчатые ретикулоциты – базофильное вещество представлено густой сеткой;
4. Неполносетчатые формы - БВ осталось как отдельные нити.
5. Пылевидные ретикулоциты - мелкие зернышки в клетках и есть базофильная субстанция.

Короткосрочная «молодость»

В периферической крови здоровых взрослых людей циркулирует не более 1% молодых эритроцитов, которые, в основном, относятся к 4 и 5 группе (83%). Ретикулоцитов 3 и 4 группы значительно меньше, вместе они составляют около 18%, а 1 группа (ядерные клетки) вообще появляются только в случае усиленной регенерации.

Эритроциты пребывают в «молодом возрасте» и называются ретикулоцитами недолго: 30 – 40 часов отведенного срока они не оставляют строму костного мозга, образуя там некоторый резерв красной крови, а после выхода, который регулируется, в основном, гуморально гликопротеиновым гормоном эритропоэтином, 35 – 45 часов свободно путешествуют по кровеносным сосудам. В периферической крови ретикулоциты окончательно прощаются с «юностью» - теряет ретикулум и отправляется выполнять основные функции взрослой клетки, которую, как указывалось выше, клеткой назвать трудно – ядра-то она не имеет («дериваты клеток»).

Нужен подсчет ретикулоцитов!

При определенных обстоятельствах продукция эритроцитов в костном мозге усиливается, следовательно, выход молодых форм в кровяное русло повышается или, наоборот, угнетение кроветворения будет затормаживать выход ретикулоцитов и тогда их количество в крови будет понижено. Попытка оценить эффективность эритропоэза, как правило, начинается с подсчета свежевышедших из костного мозга красных кровяных телец.

Использовать в клиническом анализе обозначение RET заставляют и подозрения об усиленном разрушении эритроцитов в крови (гемолиз). Однако, выясняя причину разрушения клеток, встает вопрос: как костный мозг реагирует на подобные события, старается ли он возместить потери молодыми формами или остается безучастным? Кроме этого, повышенные (или пониженные) молодые эритроциты могут информировать о поведении костного мозга и при других обстоятельствах:

• Применение лекарственных средств, влияющих на работу главного кроветворного органа (препараты железа, витаминотерапия В 12 и фолиевой кислотой);
• Лечение эритропоэтином, который, как известно, контролирует выход ретикулоцитов из костного мозга);
• Состояние костного мозга после трансплантации донорского органа.

Ретикулоциты повышены – что это значит?

Повышенные значения содержания молодых форм в популяции клеток эритроцитарного звена могут свидетельствовать о наличии различных патологических процессов и реакции костного мозга на их присутствие:

1. Вряд ли кровопотеря, особенно массивная, не заставит интенсивно работать здоровый мозг – ведь убытки нужно как можно скорее восполнять, поэтому количество ретикулоцитов может быть повышено до 10 – 12 % (‰ или 100 – 120 ретикулоцитов на 1000 эритроцитов – 1/10 часть).
2. Разрушение красных кровяных телец по причине попадания гемолитических ядов или в силу других обстоятельств также не оставит «равнодушным» костный мозг - усиленный распад зрелых эритроцитов всенепременно повысит долю молодых форм (иногда эта доля может достигать 50%).
3. Не проходит незамеченным и такое серьезное заболевание как гемолитическая анемия, приводящая к повышению RET аж на 300%, то есть, уже не ретикулоциты нужно искать в эритроцитах, а наоборот, поскольку все формы будут молодыми, а взрослые успеют разрушиться.
4. Сопровождается ретикулоцитозом и другая гематологическая патология (полицитемия, талассемия), а также метастазы в костный мозг неоплазий различной локализации.
5. Повышены значения ретикулоцитов будут в случае острой гипоксии (кислородное голодание) в силу различных обстоятельств, которые могут преследовать человека от момента рождения до старости.
6. Причиной повышенных количеств молодых клеток могут стать такие инфекции, как малярия.
7. Ретикулоцитоз наблюдается при эффективном лечении препаратами железа при ЖДА (через 1-2 недели), возможен скачок до 200% (ретикулоцитарный криз) приблизительно через неделю от начала терапевтических мероприятий в случае В 12 -фолиеводефицитной анемии.

Мало или вовсе отсутствуют

Падение уровня ретикулоцитов наблюдается при угнетении эритроцитарного ростка кроветворения и снижении продукции полноценных эритроцитов по разным причинам, из которых можно выделить:

• Апластическую анемию, при которой страдают все линии кроветворения;
• Заболевания почек, тормозящие синтез эритропоэтина, необходимого для регуляции выхода молодых клеток из костного мозга;
• Аутоиммунные гематологические заболевания;
• Недостаток витамина В 12 и фолиевой кислоты, который весьма негативно влияет на функцию костного мозга, поскольку нужен для созревания клеток. В данном случае развитие останавливается на уровне эритробласта: клетки больших размеров, ломкие, поэтому не пластичные, не обладающие способностью просачиваться в узкие капилляры (мегалобластная анемия);
• Алкоголизм (какое уж тут обновление крови?);
• Микседему;
• Метастазы новообразований в костную систему.

В заключение

Поиск и подсчет ретикулоцитов производится в 1000 эритроцитов, поэтому относится к общему анализу крови. Если у человека все нормально, то теряется всякий смысл производить отдельную окраску и искать молодые формы, которые в подобных случаях никакой информации не несут. Другое дело, если появляются подозрения, что с эритроцитарной линией что-то не так - тогда данные клетки могут в некоторой степени и прояснить ситуацию.

Между тем, в иных случаях, воспринимая это исследование, как отдельное, люди спрашивают, как подготовиться к анализу, чтобы получить достоверный результат. Традиционно ОАК сдают натощак, для ретикулоцитов и это не принципиально, поэтому можно не беспокоиться. К тому же, если для анализа взята венозная кровь или тест производится автоматическим анализатором высокого класса, то и посещать лабораторию второй раз не придется. Все будет отмечено в общем анализе крови.

Ретикулоциты подсчет

Ретикулоциты - показатель количества клеток, предшественников эритроцитов, образующихся в костном мозге. Ретикулоциты - молодые эритроциты отражают регенеративную способность костного мозга. Подсчет ретикулоцитов используют для оценки интенсивности кроветворения. Исследование проводят при: уменьшении количества эритроцитов, подозрении на гемолиз, оценке эритропоэза, при лечении анемий препаратами железа и витамином В 12 , эритропоэтином.

Ретикулоциты - это безъядерные, незрелые эритроциты, созревание которых происходит в течениеч после выхода в периферическую кровь из костного мозга. Количество образовавшихся ретикулоцитов отражает эритропоэтическую активность костного мозга. Иными словами, содержание ретикулоцитов отражает скорость образования эритроцитов и служит показателем ответа костного мозга на анемизацию.

Помимо общепринятых параметров ретикулоцитов - абсолютного и относительного (%) содержание ретикулоцитов, появление новых гематологических анализаторов (окраска специальными красителями для нуклеиновых кислот) дало возможность получать дополнительные ретикулоцитарные параметры:

ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);

ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);

незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями является на практике наиболее используемым методом подсчета количества ретикулоцитов. Это связано с тем, что метод простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, в связи с чем может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

Реактивы

Можно использовать один из следующих красителей:

1. Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.
2. Раствор азура I: азур I – 1 г, аммония оксалат – 0,4 г, натрия хлорид – 0,8 г, этиловый спирт 96% - 10 мл, дистиллированная вода – 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2 – 3 дня в термостат при 37° C и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.
3. Раствор азура II: азур II – 1 г, натрия цитрат – 5 г, натрия хлорид – 0,4 г, дистиллированная вода – 45 мл. Раствор оставляют в термостат при 37° C на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15 – 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Специальное оборудование

Ход определения

Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Окраска ретикулоцитов на стекле

При окраске ретикулоцитов на стекле хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из перечисленных выше красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Стеклографом маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Перед проведением анализа готовят влажную камеру. Обычно для этого пользуются чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3 – 10 мин. Затем высушивают мазки на воздухе.

Окраска ретикулоцитов в пробирке

Окраска ретикулоцитов в пробирке отличается при использовании разных красителей.

Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим.

Перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски бриллиантового крезилового синего. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут. Затем снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2 - окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II.

В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут. Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3 - окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I.

В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В настоящее время в продаже имеются готовые красители для ретикулоцитов заводского изготовления. Окраска ретикулоцитов с их помощью производится согласно прилагаемой инструкции.

Подсчет ретикулоцитов.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Фотографии ретикулоцитов:

Находят поля зрения, где эритроциты располагаются раздельно. В этих полях зрения необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Большая точность получается при подсчете на 2000 – 3000 эритроцитов.

В связи с тем, что в поле зрения располагается большое количество эритроцитов, что затрудняет подсчет, необходимо ограничить (уменьшить) поле зрения. Для этого можно воспользоваться либо специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров, либо воспользоваться специальным «окошком» (из бумаги вырезают круг диаметром несколько меньше окуляра, в центре круга вырезают небольшой ромбик и вставляют полученное окошко в окуляр).

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 100 (в процентах) или на 1000 (в промилле) эритроцитов.

Пример: При подсчете в мазке 1000 эритроцитов выявлено, что 15 эритроцитов из 1000 имеют зернисто-сетчатую субстанцию той или иной степени, то есть являются ретикулоцитами. Следовательно, количество ретикулоцитов в данном случае составляет 1,5% или 15‰.

Литература:

• Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под редакцией Меньшикова В. В. - Москва, «Медицина», 1987 г
• Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы - «Клинические лабораторные исследования» - Москва, «Медицина», 1984 г.

Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии

Метод подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества.

Ретикулоциты

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Патологические включения в эритроцитах

Тельца Жолли (тельца Хауэлла-Жолли) - мелкие круглые фиолетово-красные включения размероммкм, встречаются по 1 (реже по 2 - 3) в одном эритроците. Предсталяют собой остаток ядра после удаления его РЭС. Выявляются при интенсивном гемолизе и "прегрузке" РЭС, после спленэктомии, при мегалобластной анемии..

Цитохимическое исследование липидов

Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Анализ мочи по Нечипоренко

Метод Нечипоренко в отечественной лабораторной диагностике является наиболее распространенным методом количественного определения форменных элементов в моче. Этот метод наиболее прост, доступен любой лаборатории и удобен в амбулаторной практике, а также имеет ряд преимуществ перед другими известными количественными методами исследования осадка мочи. По методу Нечипоренко определяют количество форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и цилиндров) в 1 мл мочи.

©18 Лабораторная диагностика

Подсчет ретикулоцитов в мазке крови (количеств)

Что такое ретикулоциты (Reticulocytes)?

Ретикулоциты – молодые формы эритроцитов (предшественники зрелых эритроцитов), содержащие зернисто-нитчатую субстанцию, выявляемую при специальной (суправитальной) окраске. Ретикулоциты выявляются как в костном мозге, так и в периферической крови. Время созревания ретикулоцитов составляет 4-5 дня, из них в течение 3 дней они созревают в периферической крови, после чего становятся зрелыми эритроцитами. У новорожденных ретикулоциты обнаруживаются в большем количестве, чем у взрослых.

Число ретикулоцитов в крови отражает регенеративные свойства костного мозга. Их подсчет имеет значение для оценки степени активности эритропоэза (продукции эритроцитов): при ускорении эритропоэза доля ретикулоцитов возрастает, а при замедлении снижается. В случае усиленного разрушения эритроцитов доля ретикулоцитов может превышать 50%. Резкое снижение количества эритроцитов в периферической крови может привести к искусственному завышению числа ретикулоцитов, так как последний рассчитывается в % от всех эритроцитов. Поэтому для оценки тяжести анемий используют «ретикулярный индекс»: % ретикулоцитов х гематокрит / 45 х 1,85, где 45 – нормальный гематокрит, 1,85- количество суток, необходимых для поступления новых ретикулоцитов в кровь. Если индекс < 2 – говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, если > 2-3, то происходит увеличение образования эритроцитов.

Показания к назначению анализа:

• диагностика неэффективного гемопоэза или снижения продукции эритроцитов;
• дифференциальная диагностика анемий;
• оценка реакции на терапию препаратами железа, фолиевой кислоты, витамина В12, эритропоэтином;
• мониторинг эффекта трансплантации костного мозга;
• мониторинг терапии эритросупрессорами.
• Подготовка к исследованию: исследование проводят натощак или как минимум через 2 часа после
• последнего приема пищи, при взятии крови необходимо избегать длительного сжатия вены жгутом.

Когда число ретикулоцитов увеличивается (ретикулоцитоз)?

• Постгеморрагичекая анемия (ретикулоцитарный криз, увеличение в 3-6 раз).
• Гемолитическая анемия (до 300%).
• Острый недостаток кислорода.
• Лечение В12-дефицитной анемии (ретикулоцитарный криз надень терапии витамином В12).
• Терапия железодефицитных анемий препаратами железа (день лечения).
• Талассемия.
• Малярия.
• Полицитемия.
• Метастазы опухолей в костный мозг.

Когда число ретикулоцитов уменьшается?

• Апластическая анемия.
• Гипопластическая анемия.
• Нелеченная В12-дефицитная анемия.
• Метастазы новообразований в кости.
• Аутоиммунные заболевания системы кроветворения.
• Микседема.
• Заболевания почек.
• Алкоголизм.

Ретикулоциты

Ретикулоциты- молодые эритроциты, обра­зующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов явля­ется наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выяв­ляется при специальном методе окраски - суправитальном (прижизненная), т. е. без предварительной фикса­ции клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных ретикулоцитах отличается полимор­физмом; чем клетка моложе, тем субстанция более обильная. У самых молодых ретикуло­цитов она имеет форму густого клубка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, от­дельных нитей и затем отдельных зерен. В маз­ках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цве­та - полихроматофильны, т. е. окрашены раз­ными красителями.

Определение количества ретикулоцитов про­изводится при микроскопии специально окра­шенных мазков

3.2.1 Методика окраски мазков крови на ретикулоциты по Алексееву (подсчет по Фонио)

Принцип: Метод основан на подсчете числа ретикулоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов. Готовят одновременно 2 мазка (на тромбоциты и ретикулоциты).

Реактив:рабочий раствор краски по Алексееву

Ход определения: В капилляр для определения СОЭ набирают рабочий раствор до метки 0,75 мкл, и полный капилляр крови из прокола пальца больного. Соотношение красителя к крови составляет 1:4. Смесь оставляют на 2 часа, затем делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.

Подсчет производят следующим образом: сетки ретикулоцитов окрашиваются в синий цвет. Во время подсчета эритроцитов в поле зрения считают количество ретикулоцитов. Подсчитывают 1000 эритроцитов. Результат выражают в процентах.

Нормативная величина:В крови здорового человека содержится 0,2-1,0 %

(или 2-10 даже допускается до 12 проммиль) ретикулоцитов

Клинико-диагностическое значение:Появление ретикулоцитов в периферической крови указывает на усиленную работу костного мозга и используется при оценке различных видов анемий.

Повышение количества ретикулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях

Резкий ретикулоцитоз - отмечается при гемолитической желтухе

Снижение количества ретикулоцитов при наличии анемии говорит об апластическом типе кроветворения.

По уровню ретикулоцитов в крови анемии подразделяются на:

Регенераторные(количество ретикулоцитов 0,5-5 %- это постгеморрагические анемии);

Гиперрегенераторные(количество ретикулоцитов более 5% - это гемолитические анемии);

Гипо - и арегенераторные(количество ретикулоцитов снижено или они отсутствуют, несмотря на тяжелое течение анемии- гипо - и апластические, железо- и. В 12- дефицитные анемии).

Суправитальный метод окраски ретикулоцитов.

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при окраске бриллиант-крезиловым синим без предварительной фиксации.

1 % раствор бриллиант-крезилового синего: 50 мг краски растворяют в 5 мл физиологического раствора и добавляют 20 мг цитрата натрия (раствор хранят в посуде из темного стекла, годен в течение нескольких дней).

На предметное стекло с лункой наносят 2 капли 1 % раствора краски бриллиантового крезилового синего и 1 каплю крови. Осторожно перемешивают стеклянной палочкой и смесь помещают во влажную камеру (чашку Петри, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты) на 30 минут при комнатной температуре. Затем делают мазки и высушивают.

В мазках эритроциты окрашиваются в желтовато-зеленый цвет, а зернисто-сетчатая субстанция в ретикулоцитах - в синий и фиолетовый цвет.

Мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Подсчет ретикулоцитов производят на 1000 эритроцитов (большая точность получается при подсчете эритроцитов).

Увеличение числа ретикулоцитов наблюдается при:

стимуляции эритропоэза (кровопотеря, гемолиз, ретикулоцитарный криз при успешном лечении В 12 -дефицитной анемии, острый недостаток кислорода).

Уменьшение числа ретикулоцитов наблюдается при:

угнетении эритропоэза (апластические и гипопластические анемии, нелеченные В 12 -дефицитные анемии, метастазы рака в кости),

заболеваниях почек, эндокринных заболеваниях.

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ

(1) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями. Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории. Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке. Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I). (2) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии. Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям. Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла. Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается. (3) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора. В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются. Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры: ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией); ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией); ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией); незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction). Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга. Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается болееэритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Ретикулоцитопении и ретикулоцитозы, причины развития, диагностическое значение их выявления.

Ретикулоциты

Ретикулоинты - молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выявляется при специальном методе окраски - суправитальном, т. е. без предварительной фиксации клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных ретикулоцитах отличается полиморфизмом: чем клетка моложе, тем субстанция более обильная. У самых молодых ретикулоцитов она имеет форму густого клубка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, отдельных нитей и затем отдельных зерен. В мазках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цвета - полихроматофильны, т. е. окрашены разными красителями.

Определение количества ретикулоцитов производится при микроскопии специально окрашенных мазков.

Унифицированный метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их бриллиантовым крезиловым синим, азуром I или азуром II непосредственно на стекле или в пробирке (1972).

Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто-нитчатую субстанцию ретикулоцитов.

Реактивы. Можно использовать один из следующих красителей.

1.Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96 % в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.

2.Раствор азура I, предложенный П. Н. Кориковым: азур 1 - 1 г, аммония оксалат - 0,4 г, натрия хлорид- 0.8 г, этиловый спирт 96 % 10 мл, дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2-3 дня в термостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.

3.Раствор азура II следующего состава: азур II 1 г, натрия цитрат 5 г, натрия хлорид, 0,4 г, дистиллированная вода 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течениемин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтрую). Хранят в посуде из темного стекла.

Специальное оборудование. Микроскоп.

Хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3-4 мин (можно пользоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе.

В приготовленных таким образом мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в синий цвет.

Метод 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1 % раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют намин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3: в пробирку помещают 0,3-0,5 мл раствора краски 2 и 5-6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку накрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1-2 часа (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 2-3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в синий или синевато-фиолетовый цвет.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Практически для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения.

При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр 10Х, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают.

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.

Использование способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым.

1. Раствор акридинового оранжевого на изотоническом растворе хлорида натрия и концентрации 1:5000. Для приготовления изотонического раствора рекомендуют использовать дистиллированную воду pH 5,8-6,8, Раствор акридинового оранжевого должен быть свежим; хранят его не более 3-5 дней в темном флаконе с притертой пробкой.

2. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

Можно использовать афлуоль или обычное иммерсионное масло с флюоресценцией, погашенной нитробензолом (0,3 мл нитробензола на 1 мл масла). Ю. Н. Зубжицкий в качестве нефлюореспирующего масла предлагает использовать перегнанный анизол.

Специальное оборудование. Микроскоп ультрафиолетовый МУФ-ЗМ или люминесцентный.

Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 ч). Смесь перемешивают в течение 2 мин, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17.

В препарате эритроциты не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-нитчатая субстанция светится ярко-красным цветом.

Замечено, что в крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

Метод отличается простотой и требует немного времени; благодаря яркому свечению ретикулоциты легко подсчитать.

Нормальные величины. У здоровых число ретикулоцитов составляетпромиле, или 0,2-1,2 %.

Число ретикулоцитов в крови отражает регенеративные свойства костного мозга, и оценка его широко используется при различных анемиях (см. табл. 24). Повышение количества ретпкулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях, особенно в период криза (количество ретикулоцитов может быть%), а также на фоне лечения анемии Аддисона Бирмера витамином В12 (ретикулоцитарный криз - подъем числа ретикулоцитов на 4-8-й день лечения). Снижение количества ретикулоцитов характерно для гипопластической анемии, рецидива анемии Аддисона-Бирмера

Определение количества ретикулоцитов может быть использовано для определения продукции эритропоэза и вычисления срока жизни эритроцитов.

Литература. Гомзякова Н. В. Лаб, дело, 1960, № 5, с. 38-39;

Зубжицкий Ю. Н. Лаб. дело; 1967, № 2, с. 35;

Ретикулоциты подсчет

Принцип. Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто-сетчатую субстанцию ретикулоцитов.

Реактивы. Можно использовать один из следующих красителей: 1) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном этиловом спирте. Для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса. На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски; 2) раствор азура 1 по П. Н. Корикову: азур I - 1 г; аммония оксалат - 0,4 г; натрия хлорид - 0,8 г; 96% этиловый спирт- 10мл; дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2–3 дня в термостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор хранят в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать; 3) раствор азура II: азур II - 1 г; натрия цитрат - 5 г; натрия хлорид - 0,4 г; дистиллированная вода - 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15–20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Ход определения. Окраска на стекле. Хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки.

Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее топкий мазок и немедленно помещают во влажную камеру на 3–4 мин (можно пользоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты, марли или фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе.

В приготовленных таким образом мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция - в синий цвет.

Окраска в пробирке. Методика 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на 1 каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски (реактив 1). В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Методика 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20–30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Методика 3: в пробирку вносят 0,3–0,5 мл раствора краски 2 и 5-6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1–1,5 ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1,5–3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Подсчет ретикулоцитов. В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция - в синий или синеватофиолетовый цвет.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов (большая точность получается при подсчете 2000–3000 эритроцитов) и отметить среди них количество клеток, содержащих зернисто-сетчатую субстанцию. На практике для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения.

При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр 7×, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

Определение количества ретикулоцитов – клинический анализ крови, при котором осуществляется подсчет молодых эритроцитов, производимых костным мозгом. Исследование дополняет общий анализ крови. Подсчет ретикулоцитов выполняется для дифференциальной диагностики различных типов анемий, оценки функционирования костного мозга и селезенки, мониторинга состояний пациентов с железодефицитом, дефицитом витамина В12 или фолиевой кислоты, почечной недостаточностью, онкологическими заболеваниями. Забор крови для исследования производится из вены или капилляров. Показатель ретикулоцитов определяется при помощи метода проточной цитофлуориметрии. Референсные значения для мужчин – 23-70 тыс/мкл, для женщин – 17-63,8 тыс/мкл. Сроки выполнения анализа не превышают 1 рабочего дня.

Ретикулоциты – предшественники эритроцитов. Они производятся костным мозгом при дифференцировке и делении стволовых клеток. Большая часть ретикулоцитов находится в костном мозге, в кровоток в основном попадают уже зрелые эритроциты. Доля ретикулоцитов в крови – около 0,5-2%. При выполнении анализа определяется количество клеток этого типа и их процент от общего числа эритроцитов. Результаты позволяют оценить производство красных кровяных клеток в костном мозге, выявить степень активности этого процесса.

Организмом поддерживается стабильный уровень эритроцитов в крови. При снижении их количества в результате гемолиза, нарушения синтеза, кровотечения включаются компенсаторные механизмы восстановления нормальной концентрации. По изменению уровня и процента ретикулоцитов можно установить усиление производства красных кровяных клеток в костном мозге или угнетение этого процесса. Если костный мозг функционирует нормально, то потеря эритроцитов приводит к последующему увеличению их количества и количества ретикулоцитов. Понижение уровня этих типов клеток происходит при поражении красного костного мозга опухолью, метастазами, лучевой терапией и химиотерапией. Для проведения анализа на ретикулоциты биоматериалом является капиллярная или венозная кровь. Исследование выполняется с помощью гематологического анализатора методом проточной цитометрии. Результаты применяются в общетерапевтической практике, в гематологии, педиатрии, инфекционистике, хирургии.

Показания

Анализ на ретикулоциты используется для оценки производства эритроцитов костным мозгом. Результаты исследования позволяют дифференцировать различные виды анемий. По уровню ретикулоцитов они подразделяются на гипорегенераторные и регенераторные. В первом случае показатели теста снижены, производство эритроцитов недостаточное, функции костного мозга угнетены. К этой группе относятся гемолитические анемии при хронических заболеваниях, общей интоксикации, кахексии, дефиците белков, железа, витаминов. Регенераторные анемии сопровождаются компенсаторным повышением уровня ретикулоцитов на фоне усиленного разрушения или потери эритроцитов. К этой группе относятся постгеморрагические и некоторые гемолитические анемии. Анализ на ретикулоциты может использоваться для установления тяжести анемии, тогда его результаты дополняются показателями уровня эритроцитов, гемоглобина и эритроцитарными индексами.

Определение уровня ретикулоцитов показано при сниженном уровне эритроцитов, гемоглобина, при жалобах на частую усталость, головные боли, одышку, кровь в моче или стуле. При установленном диагнозе анемии анализ назначается с целью оценки эффективности лечения. Особенно часто он используется для мониторинга анемий, вызванных дефицитом железа, витамина B12 или фолиевой кислоты, а также развивающихся на фоне почечной недостаточности, хронических заболеваний. Для исследования функции костного мозга тест на ретикулоциты показан при повышенном уровне эритроцитов, для определения причины полицитемии.

Анализ на ретикулоциты в крови не используется для установления диагноза. Его основное назначение в клинической практике – составление плана дальнейших диагностических процедур и контроль успешности терапии. Количество ретикулоцитов в крови относительно стабильно, поэтому при снижении уровня эритроцитов и гематокрита показатели анализа становятся искусственно завышенными. Избежать этого помогает расчет ретикулоцитарного индекса – абсолютного числа ретикулоцитов (процент ретикулоцитов умноженный на показатель гематокрита). Еще одной особенностью данного исследования является то, что результаты указывают на недавнюю активность костного мозга, так как незрелые эритроциты циркулируют в крови в течение 2 дней.

Подготовка к анализу и забор материала

Кровь для анализа на ретикулоциты рекомендуется сдавать с утра, натощак. Минимальный промежуток между приемом пищи и процедурой – 3-4 часа. Не менее чем за сутки необходимо отказаться от интенсивных физических нагрузок, употребления алкоголя, избегать воздействия стрессовых факторов. При назначении анализа стоит сообщить врачу об используемых лекарствах, так как некоторые препараты влияют на уровень ретикулоцитов в крови. За 30 минут до процедуры забора нужно отказаться от курения, исключить физическое и эмоциональное напряжение.

Уровень ретикулоцитов определяется в капиллярной или венозной крови. Соответственно забор производится из безымянного пальца или из локтевой вены. Кровь помещается в пробирку с антикоагулянтом и направляется в лабораторию. В настоящее время для подсчета ретикулоцитов практически везде используются гематологические анализаторы. Исследование выполняется методом проточной цитометрии – клетки в потоке жидкости перемещаются через очень узкий капилляр и учитываются при облучении лазером. Сроки исполнения анализа – 1 день.

Нормальные значения

В результатах анализа на ретикулоциты отображается абсолютное число клеток в единице объема крови и процент от общего количества эритроцитов. В норме у пациентов женского пола уровень ретикулоцитов составляет от 17*109 до 63,8*109 клеток/л, у пациентов мужского пола – от 23*109 до 70*109 клеток/л. Доля клеток этого типа в общем количестве эритроцитов изменяется с возрастом:

• с рождения до 2 недель – от 0,15 до 1,5%;
• с 2 недель до 1 месяца – от 0,45 до 1,4%;
• с 2 до 6 месяцев – от 0,25 до 0,9%;
• с 6 месяцев до 2 лет – от 0,2 до 1%;
• с 2 до 6 лет – от 0,2 до 0,7%;
• с 6 до 12 лет – от 0,2 до 1,3%;
• с 12 до 18 лет – от 0,12 до 2,05% для девушек, от 0,24 до 1,7% для юношей;
• с 18 лет – от 0,59 до 2,07% для женщин, от 0,67 до 1,92% для мужчин.

Физиологическое повышение уровня ретикулоцитов в крови происходит при кислородном голодании, вызванном подъемом на большую высоту или спуском под воду, длительным пребыванием в непроветриваемом помещении, курением, приемом алкоголя. Кроме этого, увеличение концентрации данных клеток иногда определяется у беременных и рассматривается как вариант нормы.

Повышение уровня

Причиной повышения уровня ретикулоцитов в крови может быть кровотечение. Концентрация эритроцитов снижается, чтобы ее восстановить, костный мозг увеличивает продукцию их предшественников. При остром кровотечении количество ретикулоцитов возрастает на 3 или 4 день, при хроническом – остается стойко повышенным все время. При заболеваниях сопровождающихся гемолизом (разрушением эритроцитов) показатель ретикулоцитов значительно превышает норму, иногда отклонения достигают 300%. Наиболее распространенные патологии этой группы – наследственные дефекты эритроцитов, их аутоиммунное разрушение, токсическое поражение при малярии. Другими причинами повышения уровня ретикулоцитов могут быть полицитемии, воспалительные процессы, рак костного мозга или распространение метастазов в него, восстановление функций костного мозга после лучевой и химиотерапии. При лечении анемий нормализация концентрации ретикулоцитов свидетельствует об успешности терапевтических мероприятий.

Снижение уровня

Причиной снижения уровня ретикулоцитов в крови могут быть анемии, вызванные дефицитом железа, витамина B12 или фолиевой кислоты. В таких случаях производство клеток крови сокращается из-за недостатка «строительного материала». Другой причиной снижения уровня ретикулоцитов являются анемии, развивающиеся на фоне поражений костного мозга или угнетения его функций. Изменения такого типа определяются при алкогольной интоксикации, снижении активности щитовидной железы, хронических инфекциях, аутоиммунных патологиях, заболеваниях почек, воздействии токсических веществ, в том числе лекарственных препаратов, облучении.

Лечение отклонений от нормы

В клинической практике тест на ретикулоциты чаще всего назначается после общего анализа крови при снижении показателей эритроцитов и гемоглобина. Уровень ретикулоцитов позволяет оценить функции костного мозга, синтез эритроцитов, определить тип анемии, отслеживать эффективность ее лечения. Если результаты исследования отклоняются от нормальных, стоит обратиться за консультацией к лечащему врачу – терапевту, педиатру, гематологу, хирургу. Чтобы предупредить влияние физиологических факторов на количество ретикулоцитов, необходимо исключить ситуации, вызывающие кислородное голодание – подъемы на высоту или спуски под воду, длительное пребывание в загазованном или душном помещении, курение, употребление алкоголя.

Ретикулоциты, норма которых различается в связи с множеством факторов, являются несформированными формами эритроцитов, а обнаружить их можно в составе костного мозга и периферической крови. Как правило, ретикулоциты в крови созревают за три-пять дней, а затем данные клетки превращаются в уже зрелые эритроциты. Причем количество несформированных эритроцитов существенно больше, чем у взрослых людей.

Выявление ретикулоцитов :

Выявляя ретикулоциты, норма которых определяется при помощи специальной таблицы, нужно учитывать их отличия от зрелых эритроцитов. В данной разновидности клеток крови либо содержится цельное ядро, либо его остатки наблюдаются в составе зернисто-нитчатой субстанции. Чтобы выявить количество таких клеток, необходимо изучить окраску мазка крови в лабораторных условиях. Для этого применяется синий бриллиантовый раствор, который наносится на обезжиренное и предварительно вымытое стекло, и уже затем делается мазок.

Когда выявляются ретикулоциты, норма которых различна, сразу после мазка используемое стекло следует поместить в чашку Петри - специальную влажную камеру, затем выдержать пять минут, тщательно высушить на свежем воздухе, а потом - микроскопировать. Причем субстанция зернисто-нитчатого типа внутри ретикулоцита обычно окрашивается в фиолетово-синий оттенок, а фон эритроцитов выделяется благодаря голубовато-зеленому оттенку.

Если применяется метод Гель-Мейера, окраску несозревших клеток крови можно разглядеть гораздо лучше, но для этого требуется пробирка Видаля. В данном сосуде пара капель крови смешивается с бриллиантовым раствором и хлоридом натрия, потом пробирка закрывается крышкой, а сам мазок выполняется уже через час.

Подсчет ретикулоцитов :

Рассчитывая количество несозревших клеток крови, нужно взять за основу 1000 эритроцитов, а затем рассмотреть ретикулоциты, норма которых обычно варьируется на уровне 0,2%-1,2% от количества взрослых эритроцитов. В среднем, у большинства людей число несозревших эритроцитов обычно составляет 0,7% от общего числа полностью созревших клеток крови. Если количество ретикулоцитов выше предельно допустимой нормы на 10% и больше, у человека возникает ретикулоцитоз - заболевание, сопровождающееся регулярными острыми кровотечениями и гемолитическими анемиями.

Подсчитывая ретикулоциты (норма у детей обычно высокая), стоит смотреть, чтобы их число не превысило предельные значения, характерные для взрослых. Нормативы зависят и от пола, поскольку у женщин 2,07% незрелых эритроцитов еще считается допустимым параметром, а у мужчин данный показатель не должен превышать 1,92%.

В случаях, когда уровень ретикулоцитов существенно повышен, это свидетельствует о наличии таких нарушений в организме, как малярия и талассемия, полицитемия и гипоксия, анемия, всевозможные гемолитические синдромы, но такие показатели возможны и при лечении цианкобаламином. Если уровень незрелых эритроцитов понижен, у человека может наблюдаться апластическая и гипопластическая анемия, всевозможные заболевания почек и микседема, а также распространение на кости метастазов опухолей.

Чтобы диагностировать тяжесть анемии, необходим расчет «ретикулоцитарного индекса», который рассчитывается как соотношение процента ретикулоцитов и нормальных значений гематокрита, помноженных на число суток, необходимых для поступления несозревших клеток в периферическую кровь. Если полученный индекс не превышает двойки, показатель свидетельствует о гипопролиферативном компоненте анемии, в а случае превышения двойки - показывает вероятность повышенного образования эритроцитов.