ВИЧ-инфекцию относят к категории неконтролируемых заболеваний в связи с отсутствием методов ее специфической профилактики и недостаточной эффективностью терапии. Поэтому для контроля эпидемиологической ситуации по ВИЧ-инфекции в настоящее время в основном используют скрининговые диагностические исследования. Ведущее место среди методов диагностики ВИЧ-инфекции занимает иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий выявлять у обследуемых лиц серологические маркёры возбудителя данного заболевания.

В настоящем сообщении представлены результаты определения антител к ВИЧ в сыворотке крови 40 823 человек, в число которых входили пациенты женских консультаций, поликлиник, больниц города, а также медицинских центров, специализирующихся на обследовании и лечении больных групп риска (наркоманы, пациенты с вирусными гепатитами В, С и венерическими заболеваниями). Исследования были проведены в 2005 году в лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, обладающей более чем 15-лет-ним опытом применения методов ИФА для диагностики различных инфекционных заболеваний.

Для первичного обследования образцов сыворотки крови использовали тест-систему “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2” (ЗАО “Вектор-Бест”, Новосибирск), выявляющую в обследуемых образцах сыворотки или плазмы крови человека суммарные специфические антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (иммуноглобулины классов A, G и M). В данном диагностическом наборе рекомбинантные белки ВИЧ применяются как для иммобилизации в лунки планшетов, так и в виде конъюгата с пероксидазой хрена. Оценку результатов анализа сывороток проводили в соответствии с рекомендациями инструкции к тест-системе: негативными (не содержащими антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2) считали тестируемые пробы, оптическая плотность (ОП) которых в ИФА не превышала значение ОПкрит.

При проведении скрининга в лаборатории для 40222 (98,5%) из 40823 образцов сыворотки был получен отрицательный результат ИФА, а 601 (1,5%) исследованная проба была расценена как первично положительная. В результате проведенного на следующий день повторного анализа каждой из 601 сыворотки в дублях (двух лунках планшета) 440 (73,2%) образцов были определены как положительные, а 161 (26,8%) – как отрицательные. В соответствии с рекомендациями Министерства здравоохранения и социального развития 440 положительных в скрининге сывороток были заморожены и переданы для дополнительных подтверждающих исследований в консультационно-диагностический кабинет референс-лаборатории больницы № 30 им. С.П. Бот-кина. Эти исследования были проведены с использованием иммуноферментных тест-систем “ЭКОлаб-Вироностика ВИЧ 1,2 Аг/Ат” (“ЭКОлаб”, Электрогорск), “Genscreen Plus HIV Ag-Ab” (“БиоРад”, США), а также наборов для иммуноблота. Результаты анализа 440 сывороток в подтверждающих тестах позволили сделать заключение, что 323 (73,4 %) образца являются положительными, а 102 (23,2%) – отрицательными. Для 15 исследованных проб (3,4%) был получен неопределенный результат анализа.

Следует отметить, что значения ОП, полученные в нашей лаборатории при их первичном тестировании с использованием тест-системы “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2”, для 314 (97,2%) из этих 323 положительных сывороток составляли от 0,900 до 1,780, а для 9 (2,8%) образцов – 0,500–0,900. Величины ОП, полученные при скрининге 102 отрицательных сывороток, для 52 образцов (51%) находились в интервале от 0,195 до 0,400; для 40 (39,2%) проб – 0,401–0,800; 10 (9,8 %) образцов – более 0,800.

Таким образом, в результате проведенной работы показано, что первичное обследование сывороток крови на наличие серологических маркёров ВИЧ-инфекции с использованием тест-системы “КомбиБест анти-ВИЧ-1+2” является высокоэффективным. Положительные результаты скрининга подтвердились при проведении дополнительных исследований в референс-лаборатории в 73% случаев, а ложноположительные – зарегистрированы только для 0,25% из 40 823 проанализированных сывороток.

Владельцы патента RU 2283497:

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Иммуноферментная тест-система для идентификации спектра антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) первого и второго типов, первого типа группы О и выявления антигена к вирусу иммунодефицита человека первого типа р24 включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека представляющих собой gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ-2 группы О), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВИЧ-2), антител к антигену ВИЧ 1 p24, и детектирующие реагенты, при этом вышеперечисленные антигены ВИЧ и антитела ВИЧ сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа, и для сорбции используют 96-луночные полистироловые разборные или неразборные планшеты. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности, упрощение, исключение субъективности оценки результатов. 1 з.п. ф-лы, 10 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Использование: дифференцированное выявление всех классов специфических антител к белкам вируса иммунодефицита человека 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антигена р24 ВИЧ 1.

Сущность: получение иммуноферментной тест-системы для идентификации спектра антител всех классов к отдельным белкам и ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антигена р24 ВИЧ 1 в сыворотке (плазме) крови, иммуноглобулинах и препаратах крови человека с целью идентификации спектра антител к ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О, выявления антигена р24 ВИЧ 1 и подтверждения положительных или сомнительных результатов скрининга на антитела к ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антиген р24 ВИЧ 1.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции базируется на трех направлениях: а) индикация ВИЧ и его компонентов; б) выявление антител к ВИЧ; в) определение изменений в иммунной системе. Среди существующих методов лабораторной диагностики наиболее распространены серологические - выявление антител к антигенам вируса.

Для выявления антител при ВИЧ-инфекции в основном используют иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноблотинг (ИБ). В основе ИФА лежит иммобилизация вирусных антигенов на планшетах, с которыми связываются антитела больного, а комплекс антиген-антитело выявляется с помощью конъюгированных с пероксидазой хрена моноклональных антител мыши к иммуноглобулинам G и М человека. Метод довольно специфичен и чувствителен и позволяет выявлять вирусспецифические антитела у 95% больных. Остальные 5% случаев приходятся на ранние этапы инфицирования, когда антител в сыворотке крови еще мало или на терминальные фазы болезни, когда организм уже не в состоянии синтезировать антитела в силу резкого истощения иммунной системы. Возможны также ложноположительные результаты ИФА, в основном у больных аутоиммунными и онкологическими заболеваниями, а также при инфекции, вызванной вирусом Эшптейна-Барр. При этом происходит перекрестная реакция антител к ревматоидному фактору, вирусу Эпштейна-Барр или к антигенным детерминантам, похожим на белки главного комплекса гистосовместимости 1 и 2 класса (HLA-4 и DQW3) и обладающим способностью связываться с антигенами ВИЧ. Ложноположительные результаты часто наблюдаются у беременных женщин и пожилых людей. Гемолиз, липемия, бактериальное загрязнение сывороток также могут являться причиной недостоверных результатов.

В связи с этим предложен и используется ряд методов для проверки специфичности результатов обнаружения антител. Из этих методов наиболее часто применяют реакцию "иммунный блотинг" в модификации "Western Blot". Суть метода заключается в следующем: на первом этапе производят разделение белков ВИЧ по молекулярному весу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Затем осуществляется электрофоретический перенос из полиакриламидного геля на поверхность нитроцеллюлозной мембраны. Перенесенные таким образом антигены выявляются на мембране с помощью непрямого анализа: мембрана инкубируется с исследуемым материалом; содержащиеся антитела связываются с антигенами ВИЧ, перенесенными на нитроцеллюлозную мембрану, далее полоски мембраны инкубируются с конъюгатом; при образовании комплекса антиген-антитело, конъюгат присоединяется к нему, после отмывки от конъюгата и инкубации с субстратом происходит окрашивание тех участков нитроцеллюлозы, где произошло образование комплекса антиген - антитело - конъюгат. На чертеже представлены примеры положительного, слабоположительного и отрицательного результатов иммуноблота.

В сыворотке лиц, инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-2, обнаруживают антитела к следующим белкам (р) и гликопротеидам (gp): таблица А.

В таблице В представлены критерии оценки результатов иммунного блотинга, рекомендуемые ВОЗ и Российским центром по профилактике и борьбе со СПИДом.

Исходя из критериев ВОЗ, положительными считают сыворотки, в которых методом ИБ обнаруживают антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ-1. При наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании с реакцией с другими белками или без нее результат считают сомнительным. По данным Федерального научно-методического центра МЗ РФ по профилактике и борьбе со СПИДом возможна трактовка сывороток как положительных и при наличии антител только к одному белку оболочки.

Выявление антител к антигену р24 может указывать на период начала сероконверсии, так как антитела именно к этому белку появляются первыми. Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также указывать на наличие инфекции ВИЧ-2 или на неспецифическую реакцию.

Использование при диагностике ВИЧ в качестве экспертного метода реакции иммуноблотинга имеет ряд существенных недостатков:

1. Невозможность подтверждения выявления антигена р24 ВИЧ 1 в случае использования тестов, определяющих одновременно антиген и антитела к ВИЧ, что делает нецелесообразным (бессмысленным) использование в качестве скрининговых тесты для одновременного выявления антигена и антител к ВИЧ (приказ Минздрава РФ №292 от 30.07.2001: "для обследования доноров на станциях переливания крови необходимо использовать тест-системы, выявляющие одновременно антиген и антитела к ВИЧ").

2. Выявление антител только IgG класса. Невозможно полноценное подтверждение положительных результатов, полученных при использовании тестов 3 и 4 поколения (выявляющих антитела IgG и IgM).

3. Субъективность интерпретации оценки теста, особенно в случаях "сомнительных" и "неопределенных" результатов и в начальных стадиях сероконверсии (выявляемые полосы на нитроцеллюлозных мембранах в этих случаях бывают нечеткими, едва видны невооруженным глазом и при оценке разными лицами зачастую наблюдаются разногласия).

4. Невозможность автоматизированной количественной оценки результатов анализа.

5. Более низкая по сравнению с ИФА чувствительность.

6. Недолговечность хранения (при хранении полоски нитроцеллюлозной мембраны выцветают и не могут являться объективным подтверждением выявления или не выявления ВИЧ в спорных случаях).

7. Трудность при постановке реакции и хранении (полоски нитроцеллюлозной мембраны очень хрупкие и часто ломаются).

8. Высокая стоимость наборов ИБ.

Известен реагент, представляющий собой набор для одновременного определения антигенов и антител к одному и тому же патогену, в том числе ВИЧ (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Однако не раскрывается тест-система, позволяющая диагностировать ВИЧ-инфекцию на различных стадиях.

Задачей настоящего изобретения является получение тест-системы, с помощью которой достигается возможность подтверждения позитивных или сомнительных результатов скрининговых исследований на антитела к ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антиген р24 ВИЧ 1 при использовании тестов для одновременного выявления антигенов и антител.

Предлагаемое техническое решение достигается иммуноферментной тест-системой для идентификации спектра антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) первого и второго типов, первого типа группы О и выявления антигена р24 к вирусу иммунодефицита человека первого типа р24, характеризующейся тем, что она включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека, представляющих собой gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ-2 группы О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВИЧ-2), антител к антигену ВИЧ 1 р24, и детектирующие реагенты, при этом вышеперечисленные антигены ВИЧ и антитела ВИЧ сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа.

Кроме того, для сорбции используют 96-луночные полистироловые разборные или неразборные планшеты для иммуноферментного анализа.

Технический результат, достигаемый настоящим изобретением заключается в возможности подтверждения позитивных результатов на антитела к ВИЧ 1 и 2, ВИЧ 1 группы О и антиген р24 ВИЧ 1, высокой чувствительности, возможности автоматизированной интерпретации результатов, что исключает субъективность оценки, простоте выполнения теста, меньшей по сравнению с существующими наборами ИБ стоимости.

Данное техническое решение отличается от известных:

1. Использованием в качестве твердофазного носителя планшета для иммунологических реакций.

2. Одновременным использованием в качестве сорбента антител к р 24 ВИЧ и набора антигенов ВИЧ.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

Действующим началом разработанной тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР + АГ р24 ВИЧ 1" являются:

Иммуносорбент - рекомбинантные антигены, аналогичные структурным белкам ВИЧ-1: gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ 1 группы О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), ВИЧ-2: gp36 (env) и моноклональные антитела мыши к антигену ВИЧ 1(р24), сорбированные раздельно на стрипах полистиролового разборного планшета.

Для приготовления иммуносорбента используют:

1. HIV-1 gp41 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 109.

3. HIV-1 р24 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 105.

4. HIV-1 p31 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 108.

5. HIV-2 p36 - белок, продуцируемый штаммом Е.Coli №AHIV 106.

Конъюгат 1, лиофилизированный или жидкий, - моноклональные антитела мыши к антигену р24 ВИЧ1, конъюгированные с биотином.

1. Конъюгат 2, лиофилизированный или жидкий, - смесь рекомбинантных антигенов, аналогичных структурным белкам ВИЧ-1: gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ 1 группы О), gp120 (env), р24 (gag), р31(ро1); ВИЧ-2: gp36 (env), конъюгированных с биотином;

2. Конъюгаты 3, 4 - лиофилизированные или жидкие - стрептавидин, меченный пероксидазой хрена;

В ходе предварительных исследований был выбран дизайн тест-системы, отработана технология приготовления ее компонентов, оптимизированы условия проведения иммуноферментной реакции.

При постановке ИФА в тест-системе "ДС - ИФА - АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+Аг р24 ВИЧ 1" в лунки планшета с сорбированными антителами к р24 вносят по 25 мкл конъюгата-1, а в лунки с сорбированными антигенами - по 25 мкл конъюгата-2. Схема постановки реакции приведена ниже. Далее в каждую лунку вносят по 25 мкл исследуемого образца. При этом в лунках с антигенами цвет меняется с оранжевого на розовый, а в лунке с антителами - с зеленого на серый. Смесь инкубируется 45 мин при 37°С на шейкере (или 1 час при 37°С в термостате). Затем без отмывки в лунки планшета для определения антигена р24 вносят по 50 мкл конъюгата-3, а в лунки для определения антител по 50 мкл конъюгата-4. После инкубации в течение 20 мин при 37°С на шейкере (или 30 мин при 37°С в термостате) планшет промывают и проявляют субстратной смесью. Общее время реакции 1 ч 25 мин (или 1 ч 50 мин). Присутствующий в исследуемом образце антиген р24 связывается с моноклональными антителами к р24, а специфические антитела образуют комплекс с рекомбинантными антигенами на планшете. Образовавшийся иммунный комплекс анти-р24 с р24 выявляют конъюгатами анти-р24-биотин, затем стрептавидин-пероксидазой, а иммунные комплексы Аг-ВИЧ с Ат-ВИЧ - конъюгатом Аг-биотин, затем стрептавидин-пероксидазой.

Схема постановки реакции.

Учет результатов проводят спектрофотометрически при двух длинах волн: 450 /620-680 нм с настройкой прибора "по воздуху". Допустим учет результатов при одной длине волны 450 нм.

Результаты анализа учитывают, если средние значения оптической плотности (ОП) в лунках с К- не более 0,2, в лунках с К+ - не ниже 1,0. ОП крит. рассчитывают по формуле:

ОП крит. gp41 = ср. знач. ОП К-(gp41)+0,15

ОП крит. gp120 = ср. знач. ОП К-(gp120)+0,15

ОП крит. р24 = ср. знач. ОП К-(р24)+0,15

ОП крит. р31 = ср. знач. ОП К-(р31)+0,15

ОП крит. gp36 = ср. знач. ОП К-(gp36)+0,15

ОП крит. Ag р24 = ср. знач. ОП к- (Ag p24)+0,04

где 0,15 и 0,04 - коэффициенты, установленные методом статистической обработки на предприятии-изготовителе. В процессе разработки тест-системы были использованы:

1. Образцы сывороток крови здоровых доноров (n=610).

2. Образцы сывороток крови больных с различными инфекционными заболеваниями, не связанными с ВИЧ (ОРЗ, пневмонии, ангины, герпетическая и цитомегаловирусная инфекции, сифилис, хламидиоз, вирусные гепатиты А, В и С (n=224)).

3. Образцы сывороток крови больных с различными неинфекционными заболеваниями - травмы, заболевания сердечно-сосудистой системы, онкология (n=35).

4. Образцы сывороток крови беременных женщин (n=40).

5. Образцы сывороток крови, серопозитивных в ИФА и подтвержденных в иммуноблоте (n=428).

6. Образцы сывороток с положительным результатом, полученным в иммуноферментных тест-системах для одновременного определения антител ВИЧ 1,2 и антигена р24, и неопределенным результатом по иммуноблоту (n=123).

7. Внутренняя панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВИЧ 1,2, протестированная на зарегистрированных Минздравом РФ иммуноферментных тест-системах и иммуноблоте (n=21).

8. Стандарт "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Франция, кат. №72217, представляющий собой антиген, полученный из вирусного лизата.

9. Внутренний стандарт предприятия. Образец, содержащий р 24 антиген в концентрации 200 пг/мл, полученный из вирусного лизата и оттитрованный по стандарту "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" фирмы "BIO RAD", Франция, кат. №72217.

10. Стандартная панель сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ 1) - ОСО 42-28-212-93-02П, "Медико-биологический Союз", Новосибирск.

11. Стандартная панель сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека второго типа (ВИЧ 2) - ОСО-42-28-216-02П, "Медико-биологический Союз", Новосибирск.

12. Стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого типа и второго (ВИЧ 1, 2) - ОСО-42-28-214-94-02П, "Медико-биологический Союз", Новосибирск.

Оценка чувствительности тест-системы при детекции антигена р24 была проведена с использованием Стандарта "HIV I ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Внутреннего стандарта предприятия. При использовании Внутреннего Стандарта были приготовлены 4 последовательных 2-кратных разведения от 40 пг/мл до 5 пг/мл с нормальной донорской плазмой, не содержащей антител к ВИЧ 1, 2, в качестве дилюента. Наименьшее количество выявляемого антигена было принято за критерий чувствительности. Полученные данные представлены в таблице 1.

Для оценки чувствительности тест-системы при детекции специфических антител были использованы стандартные панели образцов, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита (ВИЧ 1, 2) человека (ОСО 42-28-212-93-02П с.012, ОСО 42-28-216-02П (ВИЧ 2) с.003).

Полученные данные представлены в таблицах 3, 4.

Было проведено сравнение диагностической эффективности тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" с тест-системами "Дженскрин-ВИЧ-Аг/Ат" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1/2" (Диапроф-Мед), "Вироностика ВИЧ Уни-форм II Аг/Ат" (Biomerioux), "Рекомбинант-ВИЧ1,2 ДСМ" (МБС), "Амеркард Анти-ВИЧ-1,2 К" (Амеркард), "ВИЧ-1, ВИЧ-2-ИФА-Авиценна" (Авиценна). Для этого образцы сывороток из внутренней панели были протестированы во всех указанных тестах. Представленные в таблице 5 результаты указывают на высокую диагностическую эффективность "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1".

Исследования чувствительности тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" проводились также с сыворотками крови пациентов, подтвержденных в иммуноблоте как ВИЧ позитивные. Всего протестировано 428 образцов таких сывороток. Получено несколько вариантов выявления антител к разным белкам ВИЧ и антигена р24. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6. Результаты выявления антител к разным белкам ВИЧ 1 и антигена р24 при тестировании ВИЧ 1 позитивных сывороток (n=428)
% выявления	Белковый профиль
	анти-gр41	анти-gр120	анти-р24	анти-р31	р24
51,1%	+	+	+	+	-
35,3%	+	-	+	+	-
4%	+	-	+	-	-
3,3%	+	-	-	+	-
1,4%	+	-	-	+	+
1,2%	+	+	+	+	+
1,2%	+	+	-	+	+
0,9%	+	-	+	+	+
0,7%	+	-	+	-	+
0,5%	+	-	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	-
% выявления антител к отдельным белкам или Аг р24	100%	53,9%	93,2%	94,4%	6,1%

При тестировании ВИЧ 1 позитивных образцов 3% сывороток продемонстрировали положительную реакцию с gp36 (env ВИЧ 2). ОП/ОПкрит. в этих образцах не превышал 2,0. Полученные нами данные по кросс реактивности белков внешней оболочки ВИЧ 1 (gp41) и ВИЧ 2 (gp36) совпадают с литературными данными.

Интерпретация результатов

Анализ тестирования ВИЧ позитивных сывороток и образцов из стандартных и внутренней панелей в "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" позволил разработать критерии для интерпретации результатов этого теста. Рекомендуемые критерии приведены в таблице 7.

Исходя из этих критериев, все образцы ВИЧ позитивных сывороток (n=428) определены как положительные и в "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ1". Из 16 образцов стандартной панели, содержащей антитела к ВИЧ 1, 14 определены как положительные и 2 как неопределенные. Все 8 образцов из стандартной панели, содержащей антитела к ВИЧ 2, определены как положительные. Из 10 образцов внутренней панели, содержащей антитела к ВИЧ 1, 7 определены как положительные и 3 как неопределенные.

Исследования чувствительности тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" проводились также с сыворотками крови пациентов, имеющих положительный результат в иммуноферментных тест-системах, одновременно выявляющих антитела и антиген р24, и неопределенный в иммуноблоте. Всего протестировано 123 таких образца. Данные представлены в таблице 8.

При тестировании сывороток с неопределенным результатом по иммуноблоту (n=123) в "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" 72 образца (58,5%) продемонстрировали положительный результат. Из них 26 сывороток (21,1%) позитивные только по р24, 20 (16,3%) - только по антителам, 16 (13%) - по р24 с антителами к одному из белков, 10 (8,1%) - по р24 с антителами к двум и более из белков. Таким образом, тестирование только на антитела (без выявления р24) позволило бы определить как положительные 30 образцов (24,4%). Выявление в тесте антигена р24 позволило определить как положительные дополнительно 42 образца (34,1%).

Для оценки специфичности тест-системы была использована стандартная панель сывороток, не содержащих антитела к ВИЧ 1, 2 (n=20); образцы сывороток крови здоровых доноров (n=610), образцы сывороток крови больных с различными инфекционными заболеваниями (n=224), не связанными с ВИЧ; образцы сывороток крови больных с различными неинфекционными заболеваниями - травмы, заболевания сердечно-сосудистой системы, онкология (n=35); образцы сывороток крови беременных женщин (n=40). Всего протестировано 929 образцов. Один образец из сывороток крови здоровых доноров показал ложноположительный результат - выявлены антитела к gp41 и р24. 7 образцов сывороток крови здоровых доноров и 2 образца сывороток крови больных с инфекционными заболеваниями, не связанными с ВИЧ, показали ложноположительный результат по р24.

Для оценки специфичности тест-системы была использована стандартная панель негативных образцов (ОСО 42-28-214-94-02п, с.009). Специфичность составила 100%.

Таким образом, проведенные исследования показали, что специфичность тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1" составляет 99% при исследовании образцов сывороток крови нормальных доноров и больных с различными инфекционными и соматическими заболеваниями.

Полученные данные показывают высокую диагностическую эффективность разработанной тест-системы "ДС-ИФА-АНТИ-ВИЧ 1,2-СПЕКТР+АГр24 ВИЧ 1". Тест-система может быть использована для выявления антител к отдельным белкам ВИЧ 1 и 2 типов и антигена р24 ВИЧ1 с целью подтверждения положительного результата скрининга тест-системами, выявляющими антитела, либо тест-системами, одновременно выявляющими антитела и антиген р24 ВИЧ1. Тест-система может быть использована как альтернативный иммуноблоту тест для подтверждения положительных результатов, а также для исследований динамики антител к ВИЧ и антигена р24 на разных стадиях инфекции.

ПРЕИМУЩЕСТВА ТЕСТА

1. Подтверждающий иммуноферментный тест планшетного формата

2. Подтверждающий тест, сочетающий определение спектра антител ВИЧ 1, 2 и антигена р24 ВИЧ 1

3. Выявление антител всех классов Ig

4. Чувствительность при детекции р24 не менее 5 пг/мл

5. Позволяет сократить количество неопределенных результатов по сравнению с иммуноблотом

6. Время анализа - 1 ч 25 мин (иммуноблот - от 3 до 20 часов)

7. Визуальная оценка внесения всех компонентов и образцов.

1. Иммуноферментная тест-система для идентификации спектра антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) первого и второго типов, первого типа группы О и выявления антигена р24 к вирусу иммунодефицита человека первого типа р24, характеризующаяся тем, что она включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека, представляющих собой gp41 (env ВИЧ-1 и ВИЧ-2 группы О), gp120 (env), р24 (gag), p31 (pol), gp36 (env ВИЧ-2), антител к антигену ВИЧ 1 р24, и детектирующие реагенты, при этом вышеперечисленные антигены ВИЧ и антитела ВИЧ сорбированы в разных лунках планшетов для иммуноферментного анализа.

2. Иммуноферментная тест-система по п.1, отличающаяся тем, что для сорбции используют 96-луночные полистироловые разборные или неразборные планшеты для иммуноферментного анализа.

Описание

Подготовка

Показания

Интерпретация результатов

Описание

Метод определения Иммуноферментный анализ (ИФА).

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Комбинированное выявление антител к ВИЧ типов 1 и 2 и антигена р24 ВИЧ, качественный тест.

Внимание. При положительных и сомнительных реакциях, срок выдачи результата может быть увеличен до 10-ти рабочих дней. ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), вызывающий СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) - принадлежит к семейству ретровирусов. Передается от человека к человеку при использовании загрязненных игл и шприцев для внутривенного введения наркотиков или терапевтических процедур, при сексуальных контактах, как гетеро, так и гомосексуальных. Передача вируса может произойти при переливании инфицированной крови и ее продуктов, донорстве органов или семенной жидкости, у медицинских работников - при ранении инфицированными иглами или инструментами. Заражение ВИЧ возможно путем его передачи от инфицированной матери ребенку (вертикальный путь), хотя современные методы профилактики с применением антиретровирусной терапии, при выполнении всех рекомендаций, позволяют снизить такой риск до минимума.

Процесс взаимодействия вируса с клеткой включает ряд стадий: связывание вируса с клеткой, освобождение его от оболочки, проникновение в цитоплазму, синтез ДНК по вирусной РНК, встраивание вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. После этого начинается латентная стадия инфекции. В таком состоянии провирусная ДНК может существовать некоторое время, не проявляя активности и не влияя на жизнедеятельность клетки-хозяина. Пока нет экспрессии вирусных белков, нет и иммунного ответа на вирус. Антитела к ВИЧ, характеризующие иммунный ответ организма, появляются после активации вирусной ДНК и начала активного размножения вируса. Длительность латентного периода зависит от ряда факторов, включая и индивидуальные генетические особенности организма.

Антитела к ВИЧ могут появиться, начиная со второй недели после инфицирования; их содержание увеличивается в течение 2-4-х недель и сохраняется на протяжении многих лет. У 90-95% инфицированных они появляются в первые три месяца после заражения, у 5-9% - в период от трех до шести месяцев, у 0,5-1% – в более поздние сроки.

В первые недели инфекции, еще до появления антител к вирусу (т.е. до сероконверсии), в образцах сыворотки или плазмы можно выявить присутствие антигенов ВИЧ, в том числе его капсидного белка р24. Позже, после сероконверсии, он обычно становится недетектируемым.

Комбинированные тест-системы 4-го поколения, к которым относится тест HIV Ag/Ab Combo (Architect, Abbott), выявляют как антитела к ВИЧ 1 и 2 типов, так и антиген р24 ВИЧ, что позволяет проводить раннее обнаружение инфекции. К особым характеристикам применяемого в лаборатории ИНВИТРО скринингового теста для выявления ВИЧ-инфекции стоит отнести высокую специфичность исследования (> 99,5%); 100% чувствительность анализа к антителам, характерным для периода сероконверсии, и чувствительность теста к антигену р24 порядка 18 пг/мл.

Порядок проведения лабораторного обследования на ВИЧ строго регламентирован приказами МЗ РФ и включает в себя этап скринингового (отборочного) исследования наличия антител к ВИЧ иммуноферментными (ИФА) методами, разрешенными к использованию, и этап верификационного (подтверждающего) более развернутого исследования в лаборатории городского центра СПИД. Следует отметить, что даже лучшие скрининговые ИФА-системы не гарантируют 100% специфичности, то есть существует некоторая вероятность получения неспецифических, ложноположительных результатов, связанных с особенностями сыворотки крови пациента. Поэтому положительный результат скринингового ИФА обследования может не подтвердиться в подтверждающих тестах, после чего пациенту выдадут отрицательный или неопределенный результат. При неопределенном результате подтверждающего исследования тестирование следует повторить в динамике через 2-3 недели.

Лабораторная диагностика ВИЧ инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, имеет свои особенности. В их крови до 18-ти месяцев с момента рождения могут циркулировать материнские антитела к ВИЧ (класса IgG). Отсутствие антител к ВИЧ у новорожденных не означает, что вирус не проник через плацентарный барьер. Дети ВИЧ-инфицированных матерей подлежат лабораторно-диагностическому обследованию в течение 36-ти месяцев после рождения.

Подготовка

Специальная подготовка не требуется. Рекомендуется взятие крови не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи. С общими рекомендациями для подготовки к исследованиям можно ознакомиться . Целесообразно проводить исследование на обнаружение антигена и антител к ВИЧ не раньше, чем через две недели после возможного инфицирования, с повторением его через три и шесть недель в случае отрицательного результата. Оформление заявок для проведения исследований в ООО «ИНВИТРО» осуществляется по паспорту или документу, его заменяющему (миграционная карта, временная регистрация по месту жительства, удостоверение военнослужащего, справка из паспортного стола при утере паспорта, регистрационная карта учёта из гостиницы). Предъявленный документ в обязательном порядке должен содержать информацию о временной или постоянной регистрации на территории РФ и фотографию. При отсутствии паспорта (документа его заменяющего) пациент вправе оформить анонимную заявку для сдачи биоматериала. При анонимном обследовании, заявке и полученному от клиента образцу биоматериала присваивается номер, известный только пациенту, и медперсоналу, оформлявшему заказ. ! Результаты исследований, выполненных анонимно, не могут быть представлены для госпитализации, профессиональных осмотров и не подлежат регистрации в ОРУИБ.

Показания к назначению

• Увеличение лимфатических узлов более двух областей.
• Лейкопения с лимфопенией.
• Ночная потливость.
• Резкое похудание неясной причины.
• Диарея более трех недель неясной причины.
• Лихорадка неясной причины.
• Планирование беременности.
• Предоперационная подготовка, госпитализация.
• Выявление следующих инфекций или их сочетаний: туберкулез, манифестный токсоплазмоз, часто рецидивирующая герпесвирусная инфекция, кандидоз внутренних органов, повторные невралгии герпес-zoster, вызванная микоплазмами, пневмоцистой или легионеллами пневмония.
• Саркома Капоши в молодом возрасте.
• Случайные половые контакты.

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения в Независимой лаборатории ИНВИТРО: тест качественный. Форма представления результатов: при отсутствии антител к ВИЧ 1 и 2 и антигена р24 выдается ответ «отрицательно». В случае обнаружения антител к ВИЧ или антигена в скрининговом иммуноферментном тесте пробу сыворотки отправляют для исследования подтверждающим методом иммуноблота в городской центр СПИД, который верифицирует положительные и неопределенные результаты.

Положительный результат:

1. ВИЧ - инфекция;
2. ложноположительный результат, требующий повторных или дополнительных исследований*);
3. исследование неинформативно у детей до 18 мес, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.

*Специфичность скрининговой тест-системы Антитела к ВИЧ 1 и 2 и антиген ВИЧ 1 и 2 (HIV Ag/Ab Combo, Abbott), по оценкам, представленным производителем реагентов, составляет около 99,6% как в общей популяции, так и в группе пациентов с потенциальными интерференциями (инфекции HBV,HCV, Rubella, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach. и др., аутоиммунные патологии (включая ревматоидный артрит, присутствие антинуклеарных антител), беременность, повышенный уровень IgG, IgM, моноклональные гаммапатии, гемодиализ, множественные гемотрансфузии).

Наибольшее распространение сегодня в мире получил СПИД - вирус из подсемейства ретровирусов, их называют еще лентивирусами, или «медленными». Действительно, в организме человека они начинают проявлять активность по прошествии сравнительно длительного времени, приблизительно лет через 10.

Существует иммунодефицит первого и второго типа. Но смело можно говорить об экспансии вируса первого типа. Попав в кровь и присоединившись к клетке, которая отвечает за иммунитет, вирус начинает быстро размножаться. Пока молекула СD4, отвечающая за его распознание, идентифицирует коварного врага, он успевает заразить весь организм. Поэтому чем раньше его диагностировать, тем больше шансов у больного получить своевременное лечение и дольше прожить.

Если у человека есть повод проверить себя на СПИД, сделать это следует незамедлительно. Чаще всего основа такой диагностики - определение в крови антител к иммунодефициту - белков, возникающих как реакция на присутствие вируса, а начинают они образовываться в период от 1,5 до 6 месяцев со времени возможного заражения. Соответственно и пройти диагностику целесообразнее по истечении этого периода.

Определяется количество антител, используя анализ, получивший название иммуноферментного (ИФА). Этому методу доверяют, он сравнительно точный и высокочувствительный, эти показатели составляют свыше 99, 5%. Фармацевтический рынок предлагает ряд наборов диагностических тестов для ИФА: Комбибест ВИЧ, Анти-ВИЧ 1 2, КомбиБест анти-ВИЧ, КомбиБест анти - ВИЧ 1 2, КомбиБест анти-ВИЧ 1 2 d 0172. Эти тест-системы принадлежат к третьему поколению. Недостаток указанных реагентов: они не всегда выявляют болезнь в ранние сроки. Человек уже вирусоноситель, он потенциально опасен для партнеров, но антитела в крови еще не присутствуют.

Наборы в основном оснащены количеством тестов для проведения 12*8 или 192 анти - ВИЧ анализов. Самостоятельно пользоваться ими не рекомендуется. В описании препаратов указывается, что их главное предназначение - выявить количество антител к СПИДу обоих типов. А также определить антитела всех классов к СПИДу. Если антител нет, значит, болезнь не диагностирована.

Четвертое поколение тестов «видит», кроме антител, и антигены СПИДа, они способны обнаружить инфицирование раньше, чем средства третьего поколения. Для сравнения: антиген ВИЧ есть в крови, начиная уже с 5-х суток, а первые антитела появляются не ранее, чем через месяц. КомбиБест ВИЧ 1, 2 АГ/АТ (комплект 1) и КомбиБест ВИЧ 1, 2 АГ/АТ (комплект 2) принадлежат к тестам 4-го поколения. Воспользовавшись набором этих реагентов, выявляют антитела к типу 1, 2 и антиген р24 , исследуя сыворотку или плазму человеческой крови. Многие страны применяют ИФА тестирование именно 4 поколения, которое носит еще и название Антиген/Антитело, сокращенно - АГАТ.

Проводится тестирование анонимно.