ИФА — это современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови (либо антигенов) к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

1. поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;
2. поиск антигенов каких-либо инфекционных заболеваний;
3. исследование гормонального статуса пациента;
4. обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

Как и у любого метода лабораторной диагностики ИФА имеет свои преимущества и свои недостатки. К преимуществам метода относятся:

1. высокая специфичность и чувствительность метода (более 90%);
2. возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнение количества антител в разных временных промежутках;
3. доступность и скорость данного исследования;
4. не инвазивный способ забора материала не исследование;

Недостатком метода является тот факт, что в ходе анализа удается выявить не самого возбудителя заболевания, а только иммунный ответ на него (антитела).

Суть метода ИФА

Выделяют несколько разновидностей ИФА: прямой, непрямой, метод блокирования, конкурентный. Однако на практике чаще всего используется гетерогенный твердофазный иммунный анализ или ELISA.

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса, в результате чего происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

По сути, этот процесс можно разделить на несколько этапов:

1. на поверхности лунок планшета тест-системы находится очищенный антиген определенного возбудителя. При добавлении сыворотки крови животного происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом;
2. далее, в лунку добавляется особый хромоген (конъюгат, меченный пероксидазой). Происходит ферментативная реакция, результатом которой является образование окрашенного вещества в лунке планшета. Интенсивность окраски его зависит от количества содержащихся в сыворотке животного иммуноглобулинов (антител);
3. далее происходит оценка результата. С помощью многоканального спектрофотометра, происходит сравнение оптической плотности исследуемого материала с оптической плотностью контрольных проб и математическая обработка результатов. Количество антител у пациента напрямую зависит от высоты оптической плотности данной лунки.

Нужно помнить: для каждой тест-системы разрабатываются индивидуальные показатели для учета результатов, показатели нормы и патологии («референтные значения»). Это нужно учитывать при оценке результатов каждого конкретного исследования.

Некорректно интерпретировать результаты одной лаборатории по «референтным значениям» другой лаборатории. Также некорректно сравнивать результаты разных лабораторий между собой.

При оценке результатов на конкретные инфекции имеет значение класс обнаруженных антител и их количество. От этого зависит не только вопрос этиологии инфекции, но и предполагаемая стадия заболевания (острая, хроническая), а также наличие активной инфекции (острой или обострения хронической) на момент обследования.

Каковы приблизительные сроки появления антител?

Самыми ранними антителами являются IgM. Выявить их можно через 1-3 недели после возможного инфицирования, что характеризует острую фазу инфекционного процесса. Вторая ситуация появления антител IgM – обострение хронического процесса. IgM циркулируют в среднем около 3х месяцев, затем их количество постепенно исчезает. Однако у некоторых пациентов следовые количества IgM могут обнаруживаться в течение 1-2х лет с момента инфицирования.

С 4й недели после инфицирования начинают появляться антитела IgG. При большинстве инфекций титр их постепенно увеличивается с максимумом в разные сроки (в среднем через 1,5-2 мес), далее титр остается на невысоком уровне и указывает на иммунитет. При некоторых заболеваниях уровень IgG не бывает высоким.

Варианты обнаружения антител

• Изолированное обнаружение антител IgM предполагает наличие первичного инфицирования.
• Одновременное выявление в крови IgM и IgG характерно для первичного инфицирования в предыдущие 2-3 месяца, а также при обострении хронического заболевания.
• Выявление изолированно IgG может указывать как на иммунитет к данному заболеванию, так и на хроническую инфекцию. Во второй ситуации имеет значение и количество антител (титр), и изменение этого титра в динамике. Обычно исследования проводят с интервалом в 2-4-6 недель.

ИФА или иммуноферментный анализ — современный способ определения многих патологий, в том числе инфекционного характера. Проводится исследование в лабораторных условиях. Основной задачей методики является выявление антител, их наличие указывает на проникновение в организм патогенных агентов. Современная медицина использует анализ ИФА для диагностики многих заболеваний и определения сторонних соединений.

Анализ ИФА: когда и как проводится

Методом ИФА специалистам удается выявить наличие специфических антител (иммуноглобулинов) в сыворотке крови и определить антигены. Иммуноглобулины вырабатываются вследствие сложных нейронных процессов, осуществляемых защитными функциями организма. Они являются естественной реакцией иммунитета на проникновение инородных агентов. На каждый тип патогенного микроорганизма вырабатываются специфические антитела.

Важно: по наличию определенных комплексов, методика иммуноферментного анализа позволяет выявить тип возбудителя в организме человека.

Диагностика посредством ИФА производится для обнаружения следующих заболеваний:

• герпеса;
• гепатита вирусного типа;
• вируса Эпштейна-Барра (герпеса 4 типа);
• цитомегоаловируса.

Исследование крови позволяет выявить основные болезнетворные бактерии, провоцирующие развитие сифилиса, уреаплазмоза и трихомоноза. Посредством анализа, специалисты определяют антитела к 600 видам аллергенов. Проведение иммуноферментного исследования уместно при подготовке к трансплантации органов.

Важно: в некоторых случаях, ИФА выступает дополнительной методикой определения онкологии в организме человека.

Анализ проводится исключительно в лабораторных условиях. Для исследования осуществляется забор венозной крови из локтевой вены. Результаты анализа будут доступны на следующие сутки. Для получения достоверной информации, специалисты рекомендуют соблюдать правила подготовки к ИФА:

• за сутки до исследования необходимо отказаться от употребления острой и копченой пищи;
• алкоголь находится под запретом;
• кровь сдается в утренние часы на голодный желудок;
• перед исследованием необходимо исключить любые физические и эмоциональные нагрузки;
• целесообразно отказаться от курения.

Какие патологии выявляет иммуноферментный анализ

Методом иммуноферментного анализа специалист определяет различные классы иммуноглобулинов, наличие которых указывает на развитие патологических процессов в организме. Так, основными показателями ИФА являются IgM и IgG. Наличие иммуноглобулина IgM указывает на развитие острого патологического процесса. Показатель IgG в крови характерен для стадии выздоровления.

Посредством анализа ИФА специалисты выявляют ряд опасных заболеваний. К их числу относят:

Важно: анализ ИФА назначается для подтверждения сифилиса при получении положительного результата путем сдачи крови на РВ.

Своевременная диагностика позволяет отследить эффективность проводимой терапии и в случае необходимости, провести ее корректировку.

Расшифровка анализа: положительный и отрицательный ответ

Расшифровка результатов ИФА осуществляется специалистом, на основании полученных данных. Ответ может быть как положительным, так и отрицательным.

Положительный ИФА

Результат считается положительным, если в ходе исследования в крови были обнаружены иммуноглобулины класса IgG и IgM. Наличие представленных компонентов указывает на развитие следующих заболеваний:

• сифилиса;
• гепатита вирусного типа;
• ЦМВИ (цитомегаловируса);
• герпеса;
• ветряной оспы;
• болезней, провокаторами которых выступают стафилококки и стрептококки;
• хламидиоза.

При развитии сифилиса, специфические антитела обнаруживаются в крови спустя 14 суток после заражения. По их количеству специалист определяет тяжесть течения болезни. Активная терапия сифилиса позволяет устранить все бактерии через 6 месяцев. Если лечение отсутствует, на полное восстановление организма уйдет не менее 1,5 лет.

Анализ ИФА выявляет гепатит вирусного типа еще в инкубационном периоде, до появления первых симптомов.

ЦМВИ является распространенной патологией, которая встречается у каждого третьего человека. Для населения она не несет опасности, инфицирование происходит в утробе матери.

В норме, антитела к герпетическому вирусу в организме человека отсутствуют. При их обнаружении принято диагностировать острую фазу заболевания.

При развитии ветряной оспы, в крови человека обнаруживаются специфические иммуноглобулины IgM. Они способны сохраняться в организме на протяжении 2-х лет, после полной ликвидации патологии.

Определить болезни, вызванные стрептококками и стафилококками, позволяет двукратная сдача анализа на ИФА. При повторном исследовании, уровень специфических антител стремительно возрастает.

На развитие хламидиоза указывает высокий уровень иммуноглобулина — 1:8 и выше. Показатель способен варьироваться в зависимости от прогрессирования болезни.

Внимание: для подтверждения развития определенного патологического процесса, специалист назначает дополнительные лабораторные и инструментальные исследования. Комплексное исследование позволяет назначить эффективную схему лечения.

Отрицательный ИФА

При отрицательном результате, в крови человека не обнаруживаются специфические иммуноглобулины класса IgM. Возможно наличие IgG, антитела способны сохранятся в организме после перенесенных заболеваний, бактериального и вирусного типа. В некоторых случаях, их наличие в сыворотке крови сохраняется на протяжении десятков лет.

Внимание: правильно расшифровать результаты анализа способен только опытный специалист.

Самостоятельное изучение ответов в большинстве случаев приводит к попыткам постановки диагноза и назначения некорректного лечения, без участия врача. Такое воздействие считается идеальным для дальнейшего прогрессирования патологического процесса.

Перечень доступных методик диагностики в последние десятилетия быстро расширяется, диагносты пытаются в новых методах объединить преимущества всех прежних анализов, избавившись от всех их прежних недостатков.

В последнее время все чаще в перечне диагностических процедур фигурирует иммуноферментный анализ - современный и достаточно новый тест, о котором мало известно обычному человеку, не связанному с медициной. Тем не менее эта методика стремительно пополняет ряды своих приверженцев среди квалифицированного медперсонала. Что она представляет собой и в каких случаях ее следует использовать, можно попытаться разобраться, ознакомившись с ее особенностями и главными характеристиками.

Иммуноферментное исследование - инструментально-лабораторная методика, построенная на молекулярной реакции «антиген-антитело», позволяющая обнаруживать специфичные белки в биологических материалах (образцах для исследования). Такими белками могут быть энзимы, разнообразные микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибки), простейшие и т. д.

После открытия метода ему было дано название ELISA-тест, что не имеет отношения к имени первооткрывателей, а является аббревиатурой полного названия в английском варианте - enzyme-linked immunosorbent assay. Медики всего мира используют это название, некоторые врачи в русскоязычных странах тоже так называют этот тип исследования.

Основной принцип метода заключается в молекулярной реакции «антиген-антитело».

Антигеном является любая чужая молекула, попавшая в человеческий организм в составе микроба-возбудителя болезни. Антигены представляют собой, как правило, белковые молекулы. Кроме микроорганизмов таким «чужаком» могут быть клетки чужой крови, не совпадающие по группе или резус-фактору.

В ответ на попадание такого антигена в организме запускается иммунная реакция, которая направлена на защиту от любых чужих молекул. Это происходит за счет синтеза специальных агентов иммунной системы - антител (иммуноглобулинов). Каждое антитело подходит только к определенному антигену, и нейтрализует патогенного «чужака», связываясь с ним в единый комплекс. Именно процесс такого связывания и называют реакцией «антиген-антитело».

Виды антител

Все антитела (иммуноглобулины) делятся на 5 видов в зависимости от того, на каком этапе иммунного ответа они появляются:

Для ИФА-диагностики чаще всего важны уровни иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA. По их титрам можно узнать, переболел ли человек болезнью раньше или заразился в недавнем времени, выработался ли у него иммунитет или его организм беззащитен перед патологией.

Достоинства и недостатки иммуноферментного анализа

На данный момент ИФА - один из самых точных и чувствительных методов. Он взят на вооружение специалистами в разных областях медицины и продолжает расширять сферы применения.

Преимущества метода

• Высокая точность полученных данных.
• Чувствительность (позволяет обнаружить необходимое вещество даже при минимальном присутствии возбудителя в образце).
• Возможность диагностики в первые дни болезни или в инкубационном периоде.
• Скорость получения данных в сравнении с другими методиками подобной точности.
• Высокая автоматизация процесса и минимальное участие человека, что снижает погрешность исполнителя.
• Получение данных о стадии патологического процесса и эффективности выбранной терапии.
• Безболезненность и малая инвазивность при отборе материала.

Недостатки метода

• В большинстве случаев позволяет определять ответ организма на патогенный агент, а не самого возбудителя.
• Перед исследованием должно быть точно известно предполагаемое заболевание, так как тест высокоспецифичен.
• Вероятность ложных показателей, вызванных техническими моментами, приемом лекарственных средств, одновременным присутствием нескольких хронических заболеваний или нарушениями обменных процессов в организме больного.
• Интерпретацию результатов должен делать только высококвалифицированный специалист, так как для трактовки полученных данных необходимо владеть специальной подготовкой и большим запасом медицинских знаний в определенной области.
• ИФА - достаточно редкий анализ, поэтому выполняют его далеко не во всех диагностических лабораториях.
• Метод довольно дорогой, так как помимо реактивов в лаборатории должно быть дорогостоящее многочисленное оборудование и образцы антигенов, изготавливаемых в специальных институтах.

В каких случаях используют иммуноферментный анализ

Полный перечень показаний к назначению иммуноферментного исследования очень широк, он включает в себя практически все отрасли медицины.

Чаще всего ИФА применяют для таких целей:

• выявление инфекционных заболеваний;
• диагностика венерических болезней;
• определение иммунного статуса или отдельных аутоиммунных заболеваний;
• идентификация онкомаркеров;
• определение гормонов.

В случае инфекционных и вирусных заболеваний методика позволяет выявить следующие патологии:

Кроме того, ИФА позволяет быстро и эффективно определить инфарктное состояние, оценить репродуктивный потенциал организма, выявить аллергию, ее источник и пр.

Иммуноферментная методика используется для проведения клинических исследований в ходе разработки новых лекарственных препаратов и в оценке их влияния на организм человека.

Типы образцов и методы их отбора для исследования

Чаще всего исследуемым материалом для иммуноферментного анализа служит кровь, которую берут из локтевой вены пациента. Отбор пробы проводится натощак, преимущественно в утреннее время. После отбора из крови отделяют и убирают те форменные клетки, которые мешают проведению исследования, оставляя только сыворотку.

При диагностировании мочеполовых инфекций часто материалом становятся мазки из слизистых тканей половых органов, слизь из уретры или шейки матки, образцы из прямой кишки, соскобы с эрозий или язв в области паха и с других участков тела. Мазки могут брать и с ротовой полости, а также с носоглотки.

Иногда иммуноферментное обследование используется в акушерской и гинекологической практике во время беременности для определения состояния околоплодных вод. В таком случае образцом становится амниотическая жидкость. Для этого отбирают небольшое количество жидкости, проколов плодный пузырь длинной иглой. Все манипуляции проводят стерильным инструментом, чтобы минимизировать возможные риски.

Нередко материалом становится спинномозговая или серозная жидкость. Это происходит при местной анестезии, которая вводится инъекционно.

Уточнить, какой тип материалов необходим для иммуноферментного анализа, должен специалист, направляющий на исследование. Часто берутся образцы сразу нескольких типов или из разных мест. Про подготовку к сдаче биоматериала пациенту тоже должен рассказать врач, выдающий направление на этот тип обследования.

Подготовка к иммуноферментному анализу

Для увеличения точности данных, полученных после иммуноферментного обследования, подготовка к отбору материала должна быть такой:

• за 10 суток до исследования исключить антибиотики, противовирусные и антимикотические препараты;
• за сутки необходимо исключить спиртное, курение и прием наркотических веществ;
• в этот же период необходимо избегать физического перенапряжения;
• предупредить специалиста, выписывающего назначение, о всех лекарствах, которые пациент принимает;
• оповестить врача в случае беременности или подозрении на беременность.

Лучше всего, если материалы для тестирования будут отобраны утром натощак.

Если диагностика ставит цель определить состояние гормонального фона, то важно обеспечить себе спокойное состояние накануне и избегать нервного напряжения. Для женщин сдача крови на гормоны четко определяется периодом месячного цикла, о чем будет сказано врачом в момент назначения.

За 2-3 дня до отбора материала нужно исключить из меню жареное и жирное, а перед анализом на гепатит не есть цитрусовые и любые другие фрукты и овощи оранжевого и желтого цвета.

Расшифровка результатов иммуноферментного анализа

Результат качественного исследования, как правило, обозначается знаками «+» (обнаружено) или «-» (не обнаружено).

По наличию или отсутствию определенных групп иммуноглобулинов можно делать такие выводы:

• JgM (-), JgG (-), JgA (-) - иммунитет к заболеванию полностью отсутствует (с таким типом антигена организм ранее не сталкивался);
• JgM (-), JgG (+), JgA (-) - ранее было столкновение с данным антигеном или с вакциной;
• JgM (+), JgG (-/+), JgA (-/+) - острый патологический процесс (скорее всего первичный);
• JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-) - процесс хронического течения;
• JgM (+), JgG (+), JgA (+) - рецидив;
• JgM (-) - стадия выздоровления.

Количественные значения несут большую информационную нагрузку, но трактовать их способен только лечащий врач, исходя из предыдущих показаний, возраста пациента, норм для каждого конкретного заболевания. Именно по этой причине оценивать результаты самостоятельно нельзя.

Сколько необходимо ждать результаты

Данная методика имеет много разновидностей, в зависимости от которых и определяется срок получения данных на руки. Средняя продолжительность ИФА-диагностики составляет 4-6 часов, что позволяет выдать результаты уже на следующий день.

Самые продолжительные методики занимают до 10 дней, например, в случае выявления ВИЧ-инфекции.

При острой необходимости возможно применение экспресс-методик, при которых ответ получают уже через 1-2 часа.

Где можно пройти ИФА тестирование

Поскольку оборудование для проведения такого типа диагностики довольно дорогое, то приобрести его могут не все лаборатории. Кроме того, тесты, содержащие специфические антигены, имеют ограниченный срок годности (обычно около 1 года), поэтому нуждаются в постоянном обновлении.

По этим причинам в государственных медицинских учреждениях ИФА-лаборатории есть далеко не всегда. Чаще всего необходимо обращаться в большие частные медицинские или крупные диагностические центры.

Для проведения ИФА-исследования лаборатория должна иметь специальную лицензию, а персонал и лаборанты должны пройти специальное обучение.

Чаще всего конкретный диагностический центр или лабораторию рекомендует врач, направляющий пациента на обследование.

Стоимость иммуноферментного исследования

Цена на данное исследование зависит от региона страны и от уровня клиники, предоставляющей услугу. В Москве минимальная цена за определение одного антигена стартует от 700 руб. Если необходимо выявить сразу несколько иммуноглобулинов, то цена будет суммироваться.

В случае срочного анализа стоимость увеличивается на 150-200 руб. за каждый антиген.

Несмотря на достаточно высокую стоимость, иммуноферментный анализ позволяет сделать обследование пациента максимально информативным и быстрым, что сокращает время до начала лечения и позволяет быстрее стабилизировать состояние человека.

На данном видео представлен фильм «Основы иммуноферментного анализа».

5.1 Сущность и классификация ИФА.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для индификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участие Е.Энгвалл и Р.Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р.Шурс.

Рис. 6 Основной принцип ИФА:

для выявления антигенов; 2) для выявления антител

Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 6).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.

В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала.

5.2 Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза. Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образуют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Образование конъюгата.

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введения ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою биологическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстратом, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позволяет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойствам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антигена с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками производится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляется иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы приготовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом доступных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реагентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свободного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фермента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фермента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 молекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую ферментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких образовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

Высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, уменьшить неспецифическое связывание;

Достаточной специфичностью в рабочем разведении;

Преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные формы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

Оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

Достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство определяется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

5.3 Гетерогенные методы ИФА.

Гетерогенные ИФА (или твердофазные ИФА) включают методы, в которых анализируемое соединение находится в двух фазах. Для разделения компонентов иммунохимической реакции используют твердую фазу (нерастворимый носитель, как правило, пластик) с иммобилизованными на ней антителами или антигеном, которую отмывают на каждой стадии с целью удаления промежуточных продукто непрореагировавших компонентов.

Иммобилизацию можно проводить путем ковалентного связывания антител (антигенов) с активированным носителем, используя химические подходы, а также путем физической адсорбции антител (антигенов) на поверхности твердых полимеров (например, полистирольных пластин). В зарубежной литературе это направление получило название ELISA-тест или энзимсвязанный иммуносорбентный метод (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay).

Неконкурентный ИФА определения антигенов на примере использования меченых ферментом специфических антител и иммобилизованных антител.

К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся антигенов и добавляют меченые антитела – конъюгат. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству антигена в исследуемом образце. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата добавляют хромогенный субстрат для используемого фермента, который изменяет цвет под действием фермента, т. е. происходит ферментативная реакция с окрашиванием раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству меченых ферментом специфических антител, фермента и, соответственно, исследуемого антигена. Измерения оптической плотности раствора в лунках при определенной волне (в зависимости от используемого субстрата) проводят с помощью специальных спектрофотометров, адаптированных для микропланшетов – ридеров. Количественную оценку концентрации антигена в пробе определяют, сравнивая результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартного раствора антигена.

Рисунок 7.

Поскольку на стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается связанным с молекулами иммобилизованных и меченых антител, в литературе этот метод часто называют «сэндвич»-метод (от англ. sandvich) или двухцентровый метод ИФА (от англ. two-site assay).

Этот метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых имеется, по крайней мере, две антигенные детерминанты. Для анализа большого количества моновалентных антигенов (лекарственных соединений, пестицидов и др.) он неприемлем.

Основное достоинство данного метода – высокая чувствительность. Предел обнаружения соединений данным методом в настоящее время достигает величины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600 молекул анализируемого вещества. Максимальная чувствительность достигается при проведении каждой иммунологической реакции в равновесном режиме, что сказывается на длительности проведения анализа, которая в среднем составляет 4 – 6 часов. Неконкурентный ИФА определения антител на примере использования меченых ферментом вторичных антител и иммобилизованных антигенов.

К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и отмывания от несвязавшихся антител добавляют меченые вторичные антитела, которые специфичны к анализируемым антителам. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых вторичных антител содержание ферментной метки на носителе пропорционально концентрации специфических антител в сыворотки.

Данная схема является одной из наиболее распространенных ИФА определения антител, поскольку позволяет выявлять антитела к разным антигенам.

Гетерогенный конкурентный ИФА определения антигена на примере использования меченого антигена и иммобилизованных антител.

К иммобилизованным на носителе антителам добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген и фиксированную концентрацию конъюгата антигена с ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.



5.4 Гомогенный метод ИФА.

Гомогенный иммуноферментный анализ (ГИФА) - наиболее простой в методическом отношении вид ИФА. При его постановке один из участников иммунной реакции (обычно это низкомолекулярный антиген) метится ферментом и за ходом формирования комплекса антиген-антитело следят, регистрируя изменение активности фермента.

Такое нарушение ферментативной активности может возникать либо за счет пространственного разобщения фермента и субстрата, либо за счет конформационных изменений в молекуле фермента, сопровождающих формирование иммунного комплекса. ГИФА имеет ряд существенных преимуществ перед другими иммунохимическими методами. Во-первых, высокая экспрессия (весь анализ с помощью ГИФА, занимает минуты и даже доли минут).

Рис. 8 Варианты гомогенного иммуноферментного анализа (А- эффект разобщения фермента (Ф) и субстрата (С) за счет стерических препятствий при взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат); Б- эффект изменения конформации фермента при формировании комплекса антиген- антитело).

Во-вторых, метод имеет одну стадию и не требует трудоемких и требующих времени этапов промывки. И наконец, в-третьих, метод требует минимальных объемов (8-50 мкл) и количеств биологического или клинического образца. Однако у метода ГИФА имеется один крайне существенный недостаток - на его основе можно создавать диагностические тест-системы только для низкомолекулярных антигенов. Только, в этом случае антитело, взаимодействуя с антигеном, может эффективно экранировать или модифицировать связанную с этим антигеном молекулу фермента. Именно в связи с этим, (несмотря на кажущуюся простоту и очевидные преимущества перед другими методами, на основе ГИФА были созданы диагностикумы для выявления только гормонов, пептидов, лекарственных и наркотических веществ и некоторых низкомолекулярных белков.

5.5 «Сэндвич» - вариант ИФА для выявления антигенов.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Инфекция, вызванная вирусом иммунодефицита человека, – серьезный диагноз. Ошибки при диагностике могут привести к плачевным последствиям. Анализ ИФА на ВИЧ – наиболее доступный метод исследования, но не во всех случаях он информативен.

ИФА – иммуноферментный анализ. Задача метода ИФА – выявление антител к вирусу иммунодефицита в биологическом материале. С помощью метода можно отследить присутствие в жидкости не самих вирусов, но только антител, вырабатывающихся в ответ на их присутствие. Иммуноферментный анализ широко используется при диагностике ЗППП. Он помогает выявить , передающиеся половым путем.

Существует несколько видов ИФА: прямой вариант, косвенный вариант, метод «сэндвича». В любом случае методика основана на определении наличия антител, которые служат индикатором проникновения чужеродного агента. Чтобы выявить эти «метки», биологический компонент обрабатывают ферментами.

Иммуноферментный анализ определяет антитела с точностью 96 – 98%, погрешность незначительна. Она составляет 2 – 4%.

ИФА – метод диагностики ВИЧ

ИФА анализ на ВИЧ – это первый этап диагностики. Антигенами вируса иммунодефицита являются протеины p24, p15, p17, p31 и гликопротеины gp 41, gp55, gp66, gp120, gp160.

Чтобы обнаружить вирусный белок, берут порцию крови из вены. Образец, направленный на исследование крови ИФА, обрабатывают иммуноферментными реагентами. Из крови выделяют сыворотку. Если в ходе исследования обнаруживаются , значит, в крови уже присутствует вирус.

Кровь сдают строго натощак. За 2 дня до анализа не рекомендуется есть жирную пищу и употреблять алкоголь. Следует за 14 дней прекратить прием противовирусных препаратов.

Преимущества метода:

• сравнительно небольшая стоимость;
• высокая стабильность реагентов;
• высокая чувствительность;
• короткий срок проведения;
• минимальное влияние человеческого фактора.

Современные тест-системы для ИФА производят по мировым стандартам. Это повышает точность метода.

Иммуноферментный анализ не всегда дает достоверные результаты. После попадания вируса в кровь начинается латентная (скрытая) стадия развития. Период, пока вирусы не начали размножаться, и антитела еще не сформированы, называется «время серонегативного окна». Делать ИФА на этом этапе бессмысленно. Если заражение произошло, результат будет . Как быстро вирус себя обнаружит, зависит от того, какое количество опасных клеток попало в организм. При незащищенном половом акте или переливании зараженной крови этот срок будет минимальным.

Для высокой достоверности ИФА на ВИЧ исследование проводят трижды. Сроки сдачи ИФА на вирус иммунодефицита человека:

• через 6 недель после вероятного контакта,
• через 3 месяца,
• спустя полгода.

ИФА 4 поколения на ВИЧ – метод, наиболее информативный на ранних сроках заражения. Его можно проводить уже через 1 месяц после предполагаемого инфицирования. Тест на является дорогостоящим по сравнению с аналогом 3-го поколения. Поэтому в государственных медучреждениях он используется как дополнительный метод диагностики. Бесплатно проводится тест 3. Если по его итогам однозначного ответа дать нельзя, пациента направляют на ИФА 4 поколения.

Важно! Сразу после инфицирования человек становится заразным. Он опасен для окружающих, даже когда еще не знает о своем диагнозе!

Если при ИФА выявлены антитела к антигенам ВИЧ, необходимо проводить дополнительные исследования. К таким относится . Достоверность этого метода – 80%. С помощью ПЦР исследуют кровь, сперму и влагалищные выделения. Биологическую жидкость расщепляют в медицинском реакторе, затем подвергают обработке ферментами. В итоге получают данные о том, какова концентрация клеток ВИЧ в жидкой среде. Из-за большой погрешности (20%) при положительном результате дополнительно проводят иммунный блоттинг.

Следующий этап диагностики – тест Комбо (или иммунный блоттинг). Это высокочувствительное исследование (98% достоверности), которое проводят, если через 6 месяцев результаты ИФА неоднозначны.

Расшифровка результатов ИФА

Время расшифровки составляет от 24 до 48 часов. Если необходимо получить информацию срочно (требуется хирургическое вмешательство), расшифровку проводят за 2 часа. В провинциальных медицинских пунктах не всегда есть необходимые реагенты. Пробу берут по месту обращения, затем ее передают в областной центр. При таких обстоятельствах итог можно узнать через 1- 2 недели.

Результат иммуноферментного анализа может быть либо положительным, либо отрицательным; других вариантов нет.

Даже если при первичном и повторных ИФА итог был положительным, пациента нельзя признать ВИЧ-инфицированным. Возможна погрешность. Причины ложноположительного результата:

• хронические заболевания;
• длительные инфекционные заболевания;
• беременность.

Поэтому результат анализа должен быть уточнен дополнительными исследованиями.

Если при проведении иммуноблоттинга на ВИЧ (реактивный), человек считается ВИЧ-инфицированным, а значит, что он здоров.

Клетки вируса со временем адаптируются к назначенным препаратам. Чтобы контролировать , тест ИФА периодически повторяют.

Иногда иммуноблоттинг показывает ложноотрицательный результат. Крайне редко вирус иммунодефицита 6 месяцев (и более) . Это возможно, если в кровь попало незначительное количество клеток вируса. В 0,5% от общего числа случаев диагностировать заражение удается лишь через год. В 99,5% в течение полугода после инфицирования при проведении ИФА получится достоверный результат.

Даже при проведении высокоточных исследований остается вероятность ошибки, составляющая 2%. Не следует забывать о человеческом факторе. Чтобы исключить вероятность ошибки, тест можно провести в 2-х разных учреждениях.