Имя ему СПИД Вячеслав Залманович Тарантул
Иммуноблоттинг - дополнительный непрямой метод
Кроме ИФА в определенных случаях для тестирования ВИЧ-инфекции используют процедуру, называемую «иммуноблоттинг» или «иммунный блоттинг» (иногда называют еще «вестерн-блот»). По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим. Но прежде чем подписать окончательный приговор пациенту, врач должен убедиться полностью в правильности диагноза. Поэтому вопрос о сложности и дороговизне здесь не может быть решающим.
Как по назначению, так и по способу исполнения к иммунному блоттингу хорошо подходит известное выражение «вывести на промокашку». Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану («промокашку»). Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (рис. 27). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т. п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым. В конечном итоге наличие полос на определенных участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определенным антигенам ВИЧ.
Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование с использованием набора другой серии или другой фирмы. Для подстраховки, если
Рис. 27. Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и «промокают» (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из геля на мембрану. B результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса «антиген-антитело - меченый коньюгат» определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления становится ясным, есть ли антигены в крови или их нет и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется последующее наблюдение в течение шести месяцев (исследования продолжаются через каждые три месяца).
B настоящее время в РФ для использования при диагностике ВИЧ-инфекции рекомендовано использовать пять тест-систем, среди которых имеются как российские, так и зарубежные.
Из книги Анестезиология и реаниматология автора Марина Александровна Колесникова Из книги Странности нашего тела. Занимательная анатомия автора Стивен Джуан Из книги Методичка по первой помощи автора Николай Берг Из книги Как 100 % бросить курить, или Полюби себя и измени свою жизнь автора Давид Кипнис Из книги Полный справочник по уходу за больными автора Елена Юрьевна Храмова Из книги Справочник неотложной помощи автора Елена Юрьевна Храмова Из книги КЕСАРЕВО СЕЧЕНИЕ: Безопасный выход или угроза будущему? автора Мишель Оден автора Гэри Гриффин Из книги Как увеличить размеры мужского полового члена автора Гэри Гриффин Из книги Плоскостопие. Самые эффективные методы лечения автора Александра Васильева Из книги Красота и здоровье женщины автора Владислав Геннадьевич Лифляндский Из книги Йога и сексуальные практики автора Ник ДугласИММУНОБЛОТ (western blot) - метод лабораторного исследования сыворотки крови на присутствие антител к ВИЧ; это более точный анализ, чем ИФА, и используется для подтверждения результатов ИФА. ИФА - иммуноферментный анализ (ELISA) -лабораторное исследование, позволяющее определить присутствие в крови ВИЧ-антител; тест на ВИЧ-антитела.
По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг (вестерн-блот) используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА . Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим.
Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым. Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.
Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120 , gp41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, исследования продолжаются через каждые 3 месяца.
Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и "промокают" (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из гела на мембрану. В результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала, добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса антиген - антитело - меченый коньюгат определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления все становится ясным, есть антигены в крови или их нет.
Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) - сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.
В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» - как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.». Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны. В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.
Иммуноблот включает в себя несколько стадий:
Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на "промокашку" избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.
Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым.
Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.
Полоска А - Положительный контроль
Полоска В - Слабоположительный контроль
Полоска С - Отрицательный контроль
Полоска D - Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)
В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА. При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции. Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата. При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.
Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам - структурным белкам оболочки (env) - gp160, gp120, gp41; ядра (gag) - p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) - p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.
Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 - gp36, gp105, gp140.
ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).
Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.
Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).
В практике лабораторной диагностики инфекционных заболеваний существует иногда необходимость определять антитела не вообще к патогену, а к определенным его белкам (антигенам), то есть спектр специфических антител. Если с этой целью использовать метод твердофазного иммуноферментного анализа, то в таком случае приходится предварительно из культуры патогена выделять и очищать необходимые антигены. Полученные белки наносят отдельно на твердую фазу. В случае использования 96-лу-ночного планшета - в каждую лунку по одному виду антигена. Затем определяют специфические антитела непрямым методом.
По наличию положительной реакции в лунке с тем или иным антигеном, можно судить о наличии соответствующих специфических антител. Такого рода иммуноферментные тест-системы предлагаются фирмами-производителями, однако широкое распространение, благодаря большей информативности и простоте исполнения самого исследования, получил метод иммунного блотинга (Western blot).
Иммунный блотинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагностически значимым белкам патогена. Перевод с английского Western blot означает западный перенос (дословно - промакивание). История этого необычного термина следующая.
Ученый по фамилии Саузерн (Е. Southern) в 1975 году впервые предложил метод переноса электрофорети чески разделенных фрагментов ДНК из геля на мембрану. По автору метод и был назван Southern blot, что в переводе означает «южный перенос». Метод переноса молекул РНК в свою очередь был специалистами прозван Northern blot - «северный перенос». Поначалу в шутку, а затем это название закрепилось и в официальной научной литературе.
Г. Тоубин в 1979 году опубликовал результаты первых опытов по белковому блотингу. В продолжение традиций «географических» наименований методов переноса биологических макромолекул данный метод стал именоваться «западным» переносом -Western blot.
На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, являясь поверхностно активным веществом, равномерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от размеров молекулы (молекулярной массы) белка.
В результате электрофоретической процедуры получают гелевую пластину, в толщине которой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движения они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой молекулярной массы, порядка 120-150 кДа, а к финишу далее всех продвинулись протеины массой 5-10 кДа. На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и помешают эту конструкцию между электродами источника постоянного тока. Под действием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются.
Полученный блот обрабатывается блокирующим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), которые блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист-мембрану разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержала все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем.
В коммерческих тест-системах для определения антител методом иммунного блотинга содержатся уже готовые к исследованию блоты (полоски, или стрипы). Пользователь проводит определение всего спектра специфических антител к белкам патогена по схеме непрямого метода. В качестве хромогена для проведения цветной (ферментативной) реакции используют растворимое бесцветное вещество, продукт которого приобретает окраску, становится нерастворимым и оседает (преципитирует) на нитроцеллюлозе.
В результате последовательного проведения иммунных и ферментативной реакции при наличии в исследуемой пробе антител к белкам патогена на блоте появляются темные поперечные полоски, расположение которых находится в зоне определенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена. Например: «выявлены антитела к белкам р17 и р24».
Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Однако интенсивность окраски при этом значительно ослабевает. Влажные блоты можно фотографировать или с помощью сканеров вводить их графическое изображение в память персональных компьютеров. Специальные компьютерные программы позволяют обрабатывать полученные результаты и оперативно отслеживать динамику спектра антител при динамическом наблюдении
Набор реагентов «МПБА-Блот-ВИЧ-1, ВИЧ-2» предназначен для подтверждения выявления антител к индивидуальным белкам (антигенам) ВИЧ-1 и/или ВИЧ-1 группа О и/или ВИЧ-2 в сыворотке или плазме крови человека методом иммунного блота.Отличительные особенности:
* Внутренний контроль качества обеспечивается наличием:
**Гарантия качества:
Характеристики набора реагентов «МПБА-Блот-ВИЧ-1, ВИЧ-2» определялись при тестировании образцов случайной выборки доноров, пациентов с диагнозом ВИЧ инфекция, коммерческих сероконверсионных панелей, стандартных панелей, и образцов с «потенциально мешающими определению» компонентами.
Набор реагентов не дает ложноположительных результатов при исследовании сывороток стандартной панели, не содержащих антитела к ВИЧ 1,2 и антигена ВИЧ-1(«Стандарт АТ (-) ВИЧ», № ФСР 2007/00953 от 25.10.2007 г.). Специфичность - 100 %.
Диагностическая специфичность определялась при исследовании случайной выборки 200 доноров из различных центров крови и клиник с предварительно подтвержденным отсутствием инфицирования ВИЧ-1, ВИЧ-2. Специфичность при исследовании случайной выборки доноров составила 100%;
Специфичность набора реагентов определялась при исследовании 250 образцов, включающих в себя образцы сыворотки или плазмы, полученные от беременных женщин, госпитализированных пациентов, больных гепатитом С и Е и образцы с «потенциально мешающими определению» компонентами. При использовании набора «МПБА-Блот-ВИЧ-1, ВИЧ-2» для данных образцов не было обнаружено ложно-положительных результатов.
Диагностическая чувствительность определялась с использованием:
- образцов плазмы панели Boston Biomedica, Inc HIV-1 (WWRB 301) из разных регионов, содержащих различные подтипы ВИЧ-1: группа М (субтипы A, B, C, D, E, F), и группа О; чувствительность набора реагентов составила 100%;
Чувствительность набора реагентов определялась при исследовании международных сероконверсионных панелей Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), cat. nrs. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 932, PRB 940.
Набор реагентов выявляет антитела к ВИЧ-1 в сыворотках стандартной панели, содержащей антитела к ВИЧ-1 («Стандарт АТ (+) ВИЧ-1», № ФСР 2007/00953 от 25.10.2007 г.), выявляет антитела к ВИЧ-2 в сыворотках стандартной панели, содержащих антитела к ВИЧ-2 («Стандарт АТ (+) ВИЧ-2», № ФСР 2007/00953 от 25.10.2007 г.). Чувствительность - 100%.
Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/07958 от 13 июля 2011 г. (срок действия не ограничен)
Состав:
Фотографии Антона Дергачева (кроме первой), комментарий Владимира Дергачева Идеальная супружеская пара на лебедях, которая вот-вот поцелуются. Фонтан «Супружеская или Брачная карусель» создан по мотивам немецкого средневекового поэта и композитора Ганс
Логопедическое обследование детей с церебральным параличом Логопедическое обследование детей, страдающих церебральным параличом, строится на общем системном подходе, который опирается на представление о речи как о сложной функциональной системе, структ
Александр Гущин За вкус не ручаюсь, а горячо будет:) Содержание Яркая, красивая ягода вишня содержит в себе огромное количество полезных микроэлементов и витаминов. Ее универсальность в кулинарии позволяет приготовить массу хороших, вкусных, уникаль
Ни одна кастрюля в мире не сварит пшенную кашу на молоке так вкусно, как это сделает мультиварка. И ни одна плита не справится с ее приготовлением так быстро, как мультиварка-скороварка. Простой и здоровый завтрак – сладкая пшенная каша на молоке, сдобрен
Название: Рыцарь пентаклей, Рыцарь денариев, Рыцарь монет, Воин монет, Рыцарь бубен, Путешественник, Завоеватель Дел, Всадник, Кавалер, Полезный человек, Повелитель Земель Диких и Плодородных. Значение по Папюсу: Выгода, Прибыль, Польза, Интерес. Важное
Томный август у многих Тельцов станет благоприятным временем для развития личных отношений. В этот период у представителей данного знака Зодиака возникает возможность использовать на полную катушку свое природное обаяние для успеха в сердечных делах. Чтоб