Изучение влияния клеток ито печени на стволовые клетки. Эндотелиальные клетки, клетки купфера и ито Клеточные технологии в лечении дегенеративно-дистрофических заболеваний костей и суставов

21.04.2020

Редкие невестки могут похвастаться, что у них ровные и дружеские отношения со свекровью. Обычно случается с точностью до наоборот

Вверху - схематическое изображение клетки Ито (HSC) по соседству с ближайшими гепатоцитами (PC), ниже синусоидальных эпителиальных клеток печени (EC). S - синусоид печени; KC - клетка Купфера. Внизу слева - клетки Ито в культуре под световым микроскопом. Внизу справа - электронная микроскопия позволяет разглядеть многочисленные жировые вакуоли (L) клеток Ито (HSC), в которых хранятся ретиноиды.

Клетки Ито (синонимы: звёздчатая клетка печени , жирозапасающая клетка , липоцит , англ. Hepatic Stellate Cell, HSC, Cell of Ito, Ito cell ) - перициты , содержащиеся в , способные функционировать в двух различных состояниях - спокойном и активированном . Активированные клетки Ито играют главную роль в - формировании рубцовой ткани при повреждениях печени .

В неповрежденной печени, звёздчатые клетки находятся в спокойном состоянии . В таком состоянии клетки имеют несколько выростов, охватывающих синусоидный капилляр . Другой отличительной чертой клеток является присутствие в их цитоплазме запасов витамина А (ретиноида) в форме жировых капель. Спокойные клетки Ито составляют 5-8 % численности всех клеток печени.

Выросты клеток Ито подразделяются на два типа: перисинусоидальные (субэндотелиальные) и интергепатоцеллюлярные . Первые выходят из тела клетки и простираются вдоль поверхности синусоидного капилляра , охватывая его тонкими пальцеобразными ответвлениями. Перисинусоидальные выросты покрыты короткими ворсинками и имеют характерные длинные микровыбросы, простирающиеся ещё дальше по поверхности эндотелиальной трубки капилляра. Интергепатоцеллюлярные выросты, преодолев пластинку гепатоцитов и достигнув соседнего синусоида, делятся на несколько перисинусоидальных выростов. Таким образом, клетка Ито в среднем охватывает чуть больше двух соседних синусоидов.

При повреждении печени клетки Ито переходят в активированное состояние . Активированный фенотип характеризуется пролиферацией, хемотаксисом , сокращаемостью, потерей запасов ретиноида и образованием клеток, напоминающих миофибробластные . Активированные звёздчатые клетки печени также демонстрируют повышенное содержание новых генов , таких как, ICAM-1 , хемокины и цитокины . Активация свидетельствует о начале ранней стадии фиброгенеза и предшествует повышенному продуцированию ЕСМ -белков. Финальная стадия заживления печени характеризуется усиленным апоптозом активированных клеток Ито, вследствие чего их количество резко сокращается.

Для визуализации клеток Ито при микроскопии применяется окрашивание хлоридом золота . Установлено также, что надёжным маркером для дифференциации этих клеток от других миофибробластов является экспрессия ими белка рилин .

История [ | ]

В 1876 году Карл Фон Купфер описал клетки, названные им «Sternzellen» (звёздчатые клетки). При окрашивании оксидом золота, в цитоплазме клеток были заметны включения. Ошибочно сочтя их фрагментами эритроцитов, захваченных путём фагоцитоза, Купфер в 1898 году пересмотрел свои взгляды о «звёздчатой клетке» как об отдельном типе клеток и отнес их в разряд фагоцитов . Однако в последующие годы регулярно появлялись описания клеток, похожих на Купферовские «звёздчатые клетки». Им присваивались различные названия: интерстициальные клетки, парасинусоидные клетки, липоциты, перициты. Роль этих клеток оставалась загадкой на протяжении 75 лет, пока профессор (Toshio Ito) не обнаружил в перисинусоидальном пространстве печени человека некие клетки, содержащие вкрапления жира. Ито назвал их «shibo-sesshu saibo» - жиропоглощающие клетки. Поняв, что вкрапления были жиром, выработанным клетками из гликогена , он сменил название на «shibo-chozo saibo» - жирозапасающие клетки. В

Проведен ультраструктурный, иммуногистохимический и морфометрический анализ популяции звездчатых клеток печени в динамике развития фиброза и цирроза инфекционно-вирусного генеза. Выявлена фиброгенная активация звездчатых клеток печени, которая характеризуется редукцией липидных капель и синхронной экспрессией фибробластоподобных характеристик – позитивной иммуногистохимической реакцией на гладкомышечный α-актин, гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и перицеллюлярным формированием многочисленных коллагеновых фибрилл. Показано, что, несмотря на прогрессирующее уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток при развитии фиброза, сохраняется необходимость поддержания функции депонирования ретиноидов – при циррозе печени в фиброзных септах и внутри долек обнаружены липидосодержащие звездчатые клетки. Сделано заключение, что звездчатые клетки печени – полиморфная гетерогенная популяция с широким спектром функциональной активности.

фиброгенез

звездчатые клетки печени

ультраструктура

иммуногистохимия

1. Balabaud C., Bioulac-Sage P., Desmouliere A. The role of hepatic stellate cells in liver regeneration // J. Hepatol. – 2004. – Vol. 40. – P. 1023–1026.

2. Brandao D.F., Ramalho L.N.Z., Ramalho F.S. Liver cirrhosis and hepatic stellate cells // Acta Cirúrgica Brasileira. – 2006. – Vol. 21. – P. 54–57.

3. Desmet V.J., Gerber M., Hoofnagle J.H. Classification of chronic hepatitis: Diagnosis, grading and staging // Hepatology. – 1994. – Vol. 19. – P. 1523–1520.

4. Gabele E., Brenner D.A., Rippe R.A. Liver fibrosis: Signals leading to the amplification of the fibrogenic hepatic stellate cell // Front. Biosc. – 2003. – Vol. 8. – P. 69–77.

5. Geerts A. On the origin of stellate cells: mesodermal, endodermal or neuro-ectodermal? // J. Hepatol. – 2004. – Vol. 40. – P. 331–334.

6. Gutierrez-Ruiz M.C., Gomez-Quiroz L.E. Liver fibrosis: searching for cell model answers // Liver Intern. – 2007. – Vol. 10. – P. 434–439.

7. Kisseleva T., Brenner D.A. Role of hepatic stellate cells in fibrogenesis and the reversal of fibrosis // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2007. – Vol. 22. – P. S73–S78.

8. Ryder S.D. Progression of hepatic fibrosis in patients with hepatitis C: a prospective repeat liver biopsy study // Gut. – 2004. – Vol. 53. – P. 451–455.

9. Schuppan D., Afdhal N.H. Liver cirrhosis // Lancet. – 2008. – Vol. 371. – P. 838–851.

10. Senoo H. Structure and function of hepatic stellate cells // Med. Electron. Microsc. – 2004. – Vol. 37. – P. 3–15.

Звездчатые клетки печени (липоциты, клетки Ито, жиронакапливающие клетки печени) локализуются в пространствах Диссе между гепатоцитами и эндотелиальной выстилкой синусоидов и играют ведущую роль в регуляции гомеостаза ретиноидов, депонируя до 80 % витамина А . Пространство Диссе является зоной наибольшей функциональной ответственности, обеспечивая транссинусоидальный обмен. С помощью экспериментальных моделей и в культуре клеток продемонстрировано, что звездчатые клетки печени дифференцируются по крупным цитоплазматическим липидным каплям, содержащим витамин А; этот фенотип интерпретирован как «покоящийся».

Все большее значение придается роли звездчатых клеток в развитии фиброза и цирроза печени. При получении фиброгенных стимулов «покоящиеся» звездчатые клетки «трансдифференцируются», приобретая миофибробластоподобный фенотип, и начинают продуцировать коллаген, протеогликаны и другие компоненты экстрацеллюлярного матрикса . Фиброз на уровне центральных вен, синусоидов или портальных сосудов лимитирует нормальную гемодинамику печени, что приводит к сокращению метаболически эффективной паренхимы, в дальнейшем - портальной гипертензии и порто-системному шунтированию. Накопление соединительной ткани в пространствах Диссе нарушает нормальный метаболический трафик между кровью и гепатоцитами, препятствуя клиренсу циркулирующих макромолекул, изменяя межклеточные взаимодействия и приводя к дисфункции клеток печени .

Существуют противоречивые мнения относительно того, способны ли активированные звездчатые клетки возвращаться к покоящемуся фенотипу. Получены данные о том, что фиброгенные звездчатые клетки печени могут частично нивелировать процесс активации, например, при воздействии ретиноидов или при взаимодействии с компонентами экстрацеллюлярного матрикса, в том числе с фибриллярным коллагеном I типа или компонентами базальной мембраны . Решение этого вопроса лежит в основе проблемы обратимости фиброза и разработки терапевтических подходов к лечению цирроза печени.

Цель исследования - провести комплексное изучение структурно-функциональных особенностей звездчатых клеток печени в динамике фиброзных изменений на модели хронической HCV-инфекции.

Материал и методы исследования

Проведено комплексное светооптическое, электронно-микроскопическое и морфометрическое исследование биоптатов печени при хронической HCV-инфекции на различных стадиях фиброзных изменений (100 образцов, разделенных на 4 равные группы по степени выраженности фиброза). Важно отметить, что липидосодержащие звездчатые клетки лучше всего визуализируются на полутонких срезах, фиброгенные звездчатые клетки - только на ультратонких срезах либо с помощью иммуногистохимической визуализации.

Образцы печени фиксировали в охлажденном до 4 °С 4 %-м растворе параформальдегида, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,2-7,4); парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили ШИК-реакцию. Полутонкие срезы окрашивали реактивом Шиффа и азуром II. Исследование проводили в универсальном микроскопе Leica DM 4000B (Германия). Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 320 и компьютерной программы Leica QWin. Ультратонкие срезы, контрастированные уранилацетатом и цитратом свинца, исследовали в электронном микроскопе «JEM 1010» при ускоряющем напряжении 80 кВт.

Стадию фиброза печени определяли по 4-балльной шкале, начиная от портального фиброза (I стадия) до цирроза с образованием порто-центральных васкуляризованных септ и нодулярной трансформацией паренхимы . Звездчатые клетки печени и другие матрикс-продуцирующие клеточные элементы выявляли в динамике развития фиброза по экспрессии гладкомышечного α-актина.

Экспрессию гладкомышечного α-актина в матрикс-продуцирующих клетках печени тестировали с помощью двухшагового непрямого иммунопероксидазного метода со стрептавидин-биотиновой системой визуализации продуктов реакции с негативным контролем. В качестве первичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к гладкомышечному α-актину (NovoCastra Lab. Ltd, Великобритания) в разведении 1:25; в качестве вторичных антител - универсальные биотинилированные антитела. Продукты иммуногистохимической реакции визуализировали с помощью диаминобензидина, затем срезы докрашивали гематоксилином Майера. Численную плотность липидосодержащих звездчатых клеток оценивали на полутонких срезах в единице поля зрения, равной 38000 мкм2. При статистической обработке данных применяли критерий Стьюдента; различия сравниваемых параметров считали значимыми, если вероятность ошибки P была меньше 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При минимальных фиброзных изменениях печени пациентов с хроническим гепатитом С обнаруживается, как правило, достаточно большое количество звездчатых клеток, которые хорошо видны лишь на полутонких и ультратонких срезах и дифференцируются в пространствах Диссе по наличию в цитоплазме крупных липидных капель. Превращение звездчатых клеток из «покоящихся», содержащих ретиноиды, в фиброгенные сопровождается постепенным уменьшением числа липидных капель. В связи с этим истинное количество звездчатых клеток можно определить, используя комплексное электронно-микроскопическое и иммуногистохимическое исследование.

На начальных стадиях фиброза (0, I) при хроническом гепатите С при изучении полутонких срезов популяция звездчатых клеток печени отличалась выраженным полиморфизмом - резко варьировали размеры, форма, количество липидных капель и их тинкториальные свойства: обращали на себя внимание различия в осмиофильности липидосодержащего материала в разных клетках. Численная плотность звездчатых клеток печени, визуализируемых в препаратах по наличию цитоплазматических липидных капель, составляла 5,01 ± 0,18 на единицу поля зрения.

Особенности ультраструктуры звездчатых клеток связаны с гетерогенностью электронной плотности липидных капель не только в пределах одной клетки, но и между разными липоцитами: на фоне электронно-прозрачного липидного субстрата выделялся более осмиофильный маргинальный ободок; кроме того, резко полиморфны ядра, варьировалась длина цитоплазматических отростков. Среди ультраструктурных особенностей липидосодержащих звездчатых клеток, наряду с присутствием липидных капель, можно отметить очень малое количество цитоплазматического матрикса, бедного мембранными органеллами, в том числе митохондриями, в связи с чем, по-видимому, данный фенотип липоцитов называют «покоящимся» или «пассивным» .

На стадиях фиброза II и III ультраструктура большинства звездчатых клеток приобретала так называемый смешанный, или переходный, фенотип - одновременное присутствие морфологических признаков и липидосодержащей и фибробластоподобной клетки. В таких липоцитах ядра имели глубокие инвагинации нуклеолеммы, более крупное ядрышко, увеличенный объем цитоплазмы, сохраняющей липидные капли. Одновременно резко возрастало количество митохондрий, свободных рибосом, полисом и канальцев гранулярной цитоплазматической сети. Как правило, имелся мембранный контакт липидных капель и митохондрий, свидетельствующий об «утилизации» липидов. Во многих клетках деградация липидных капель осуществлялась путем формирования аутофагосом, затем элиминирующихся путем экзоцитоза. В некоторых случаях отмечалась пролиферация звездчатых клеток смешанного фенотипа.

Матрикс-продуцирующие звездчатые клетки, наиболее многочисленные на стадии цирроза печени, характеризовались полным отсутствием липидных гранул, отростчатой фибробластоподобной формой, развитым белоксинтезирующим компартментом и формированием в цитоплазме контрактильных фибриллярных структур; перицеллюлярно в пространствах Диссе локализовались многочисленные пучки коллагеновых фибрилл со специфичной поперечной исчерченностью.

В целом, при прогрессировании хронического гепатита С, сопровождающегося внутридольковым перисинусоидальным фиброгенезом, имели место морфологические признаки активации звездчатых клеток печени, превращение их из так называемых «пассивных», накапливающих витамин А, в клетки фиброгенные и пролиферирующие.

На стадии трансформации в цирроз печени происходило значительное уменьшение численной плотности липидосодержащих звездчатых клеток, свидетельствующее об их фиброгенной трансформации. Однако при сформированном циррозе печени в единичных случаях встречались участки паренхимы печени с перисинусоидальными липидосодержащими звездчатыми клетками. Кроме того, в одном образце в перипортальной фиброзной ткани обнаружены многочисленные липоциты, что, вероятно, свидетельствует о важной роли звездчатых клеток в метаболизме ретиноидов в организме даже на стадии цирроза органа. Кроме того, по-видимому, звездчатые клетки имеют ряд других функций, они обнаружены и во внепеченочных органах, таких как поджелудочная железа, легкие, почки и кишечник, и существует мнение о том, что печеночные и внепеченочные звездчатые клетки формируют диссеминированную систему звездчатых клеток организма, аналогично APUD-системе . Например, несмотря на ассоциацию фиброгенных звездчатых клеток с циррозом печени, их активация может играть благоприятную роль в случаях острого повреждения, потому что в результате формируется соответствующий стромальный контур для регенерации паренхиматозных клеток.

Степень выраженности перигепатоцеллюлярного фиброза при хронической HCV-инфекции, по данным морфометрического анализа, имела достоверную обратную корреляцию с численной плотностью липидосодержащих звездчатых клеток - на стадии фиброза III и при циррозе органа она составляла 0,20 ± 0,03 в единице поля зрения, что достоверно меньше (р < 0,05), чем на стадиях фиброза 0 - I (5,01 ± 0,18) и II (2,02 ± 0,04).

Фиброгенная активность матрикс-продуцирующих клеток печени тестирована нами с помощью иммуногистохимического исследования по экспрессии гладкомышечного альфа-актина. Продукты иммуногистохимической реакции различной интенсивности обнаруживались в цитоплазме активированных звездчатых клеток, локализующихся внутри печеночных долек. Особенно значительная экспрессия гладкомышечного α-актина отмечалась в цитоплазме фибробластов и миофибробластов портальных зон, гладкомышечных клетках сосудов и миофибробластах вокруг центральных вен.

Большинство данных о клеточных механизмах фиброгенеза получено в исследованиях, выполненных на звездчатых клетках печени, однако очевидно, что различные матрикс-продуцирующие клетки (каждая с определенной локализацией, иммуногистохимическим и ультраструктурным фенотипом) вносят свой вклад в развитие фиброза печени . Они включают в себя фибробласты и миофибробласты портальных трактов, гладкомышечные клетки сосудов и миофибробласты вокруг центральных вен, активизирующиеся в условиях хронического повреждения печени.

Заключение

Продемонстрирована роль звездчатых клеток печени в развитии фиброза органа при хроническом гепатите С. При прогрессировании фиброза значимо уменьшается численная плотность липидосодержащих звездчатых клеток, при этом часть популяции сохраняет так называемый «покоящийся» фенотип для осуществления метаболической функции. «Миофибробластоподобные» звездчатые клетки печени в состоянии фиброгенной активации характеризуются следующими структурно-функциональными особенностями: уменьшением числа и последующим исчезновением липидных капель, гиперплазией гранулярной цитоплазматической сети и митохондрий, очаговой пролиферацией, иммуногистохимической экспрессией фибробластоподобных характеристик, в том числе гладкомышечного α-актина, и формированием перицеллюлярных коллагеновых фибрилл в пространствах Диссе.

Таким образом, звездчатые клетки печени представляют собой не статичную, а динамичную популяцию, принимающую непосредственное участие в ремоделировании внутридолькового перигепатоцеллюлярного матрикса.

Рецензенты:

Вавилин В.А., д.м.н., профессор, зав. лабораторией метаболизма лекарств НИИ молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск;

Кливер Е.Э., д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии Новосибирского НИИ патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина Минздравсоцразвития РФ, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 15.08.2011.

Библиографическая ссылка

Постникова О.А., Непомнящих Д.Л., Айдагулова С.В., Виноградова Е.В., Капустина В.И., Нохрина Ж.В. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЗВЕЗДЧАТЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ В ДИНАМИКЕ ФИБРОЗА // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 10-2. – С. 359-362;
URL: http://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=28817 (дата обращения: 30.01.2020). Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»

Строение эндотелиальных клеток, клеток Купфера и Ито , мы рассмотрим на примере двух рисунков.

На рисунке справа от текста, изображены синусоидные капилляры (СК) печени - внутридольковые капилляры синусоидного типа, увеличивающиеся от входных венул к центральной вене. Печеночные синусоидные капилляры формируют анастомотическую сеть между печеночными пластинками. Выстилка синусоидных капилляров образована эндотелиальными клетками и клетками Купфера.

На рисунке слева от текста, изображена печеночная пластинка (ПП) и два синусоидных капилляра (СК) печени срезаны вертикально и горизонтально, чтобы показать перисинусоидальные клетки Ито (КИ). На рисунке отмечены также срезанные желчные канальцы (ЖК).

Эндотелиальные клетки (ЭК) - сильно уплощенные чешуйчатые клетки с удлиненным маленьким ядром, слаборазвитыми органеллами и большим количеством микропиноцитозных везикул. Цитомембрана испещрена непостоянными отверстиями (О) и фенестрами, часто группирующимися в решетчатые пластинки (РП). Эти отверстия пропускают плазму крови, но не клетки крови, давая ей возможность доступа к гепатоцитам (Г). Эндотелиальные клетки не имеют базальной мембраны и не обладают фагоцитозом. Они соединены друг с другом с помощью небольших соединительных комплексов (не показаны). Вместе с клетками Купфера эндотелиальные клетки формируют внутреннюю границу пространства Диссе (ПД); его наружная граница образована гепатоцитами .

Клетки Купфера (КК) - большие, непостоянные звездчатые клетки внутри печеночных синусоидных капилляров, частично на их бифуркациях.

Отростки клеток Купфера проходят без каких-либо соединительных устройств между эндотелиальными клетками и часто пересекают просвет синусоидов. Клетки Купфера содержат овальное ядро, много митохондрий, хорошо развитый комплекс Гольджи, короткие цистерны гранулярной эндоплазматической сети, множество лизосом (Л), остаточные тела и редкие кольцевые пластинки. Клетки Купфера также включают большие фаголизосомы (ФЛ), которые часто содержат отжившие свой срок эритроциты и инородные вещества. Также могут быть выявлены, особенно при суправитальной окраске, включения гемосидерина или железа.

Поверхность клеток Купфера демонстрирует непостоянные уплощенные цитоплазматические складки, называемые ламеллоподиями (ЛП) - пластинчатыми ножками, а также отростки, называемые филоподиями (Ф), и микроворсины (Мв), покрытые гликокаликсом. Плазмолемма формирует червеобразные тельца (ЧТ) с центрально расположенной плотной линией. Эти структуры могут представлять конденсированный гликокаликс.

Клетки Купфера - это макрофаги, весьма вероятно, формирующие самостоятельный род клеток. Они обычно происходят от других клеток Купфера вследствие митотического деления последних, но могут также происходить из костного мозга . Некоторые авторы полагают, что они являются активизированными эндотелиальными клетками.

Иногда случайное автономное нервное волокно (НВ) проходит через пространство Диссе. В некоторых случаях волокна имеют контакт с гепатоцитами. Края гепатоцитов отграничены межгепатоцитными углублениями (МУ), усеянными микроворсинками.

Это звездчатые клетки, локализованные внутри пространств Диссе (ПД). Ядра их богаты конденсированным хроматином и обычно деформированы большими липидными каплями (ЛК). Последние присутствуют не только в перикарионе, но и в отростках клетки и видимы снаружи как сферические протрузии. Органеллы развиты плохо. Перисинусоидальные клетки демонстрируют слабую эндоцитотическую активность, но не обладают фагосомами. Клетки имеют несколько длинных отростков (О), которые контактируют с соседними гепатоцитами, но не образуют соединительных комплексов.

Отростки охватывают синусоидные капилляры печени и в некоторых случаях проходят через печеночные пластинки, вступая в контакт с соседними печеночными синусоидами. Отростки не постоянны, разветвлены и тонки; они могут быть также уплощенными. Накапливая группы липидных капель, они удлиняются и приобретают вид виноградной кисти.

Считается, что перисинусоидальные клетки Ито - это слабодифференцированные мезенхимные клетки, которые могут рассматриваться как гемопоэтические стволовые клетки, так как они могут в патологических условиях трансформироваться в жировые клетки, активные кровяные стволовые клетки или в фибробласты.

В нормальных условиях клетки Ито вовлечены в аккумуляцию жира и витамина А так же, как и в продукцию внутридольковых ретикулярных и коллагеновых волокон (KB).

Гены & Клетки: Том V, №1, 2010 год, стр.: 33-40

Авторы

Гумерова АА., Киясов А.П.

Регенеративная медицина - одна из наиболее бурно развивающихся и многообещающих областей медицины, в основу которой заложен принципиально новый подход к восстановлению поврежденного органа путем стимулирования и (или) использования для ускорения регенерации стволовых (прогени-торных) клеток. Чтобы претворять этот подход в жизнь, необходимо знать, что же представляют собой стволовые клетки, и, в частности, региональные стволовые клетки, каков их фенотип и потенции. Для ряда тканей и органов, таких, как эпидермис и скелетная мышца, стволовые клетки уже идентифицированы и описаны их ниши. Однако печень - орган, регенераторные способности которого известны с античных времен, до сих пор не раскрыл своей главной тайны - тайны стволовой клетки. В этом обзоре на основе собственных и литературных данных мы обсуждаем выдвинутую гипотезу о том, что на роль стволовой клетки печени могут претендовать перисинусоидальные звёздчатые клетки.

Перисинусоидальные клетки печени (клетки Ито, звездчатые клетки, липоциты, жиронакапливающие клетки, витамин-А-накапливающие клетки) - один из самых загадочных клеточных типов печени. История изучения этих клеток насчитывает уже более 130 лет, и до сих пор вопросов, касающихся их фенотипа и функций, намного больше, чем ответов. Клетки были описаны в 1876 г. Купфером, названы им звёздчатыми клетками и отнесены к макрофагам . Позднее имя Купфера получили истинные оседлые макрофаги печени.

Общепринято, что клетки Ито располагаются в пространстве Диссе в непосредственном контакте с гепа-тоцитами, накапливают витамин А и способны вырабатывать макромолекулы межклеточного вещества , а также, обладая сократительной активностью, регулируют кровоток в синусоидных капиллярах подобно перицитам . Золотым стандартом для идентификации клеток Ито у животных является выявление в них белка промежуточных филаментов цитоскелета, характерного для мышечной ткани - десмина . Другими достаточно распространенными маркерами этих клеток являются маркеры нейрональной дифференцировки - кислый глиальный фибриллярный протеин (Glial fibrillary acid protein, GFAP) и нестин .

Долгие годы клетки Ито рассматривались только с позиций их участия в развитии фиброза и цирроза печени . Это связано с тем, что при повреждении печени всегда происходит активация этих клеток, которая заключается в усилении экспрессии десмина, пролиферации и трансдифференцировке в клетки, подобные мио-фибробластам (myofibroblasts-like cell transformation), экспрессирующие --гладкомышечный актин (--ГМА) и синтезирующие значительные количества межклеточного вещества, в частности, коллагена I типа . Именно деятельность таких активированных клеток Ито и приводит, по мнению многих исследователей, к развитию фиброза и цирроза печени .

С другой стороны, постепенно накапливаются факты, позволяющие взглянуть на клетки Ито совершенно с неожиданных позиций, а именно - как на важнейший компонент микроокружения для развития гепатоцитов, холангиоцитов и клеток крови во время печеночного этапа кроветворения, и, более того, как на возможные стволовые (прогениторные) клетки печени. Цель настоящего обзора - анализ современных данных и взглядов на природу и функциональное значение этих клеток с оценкой их возможной принадлежности к популяции стволовых (прогениторных) клеток печени.

Клетки Ито являются важнейшим участником восстановления паренхимы в ходе регенерации печени за счет вырабатываемых ими макромолекул межклеточного матрикса и его ремоделирования, а также продукции факторов роста . Первые сомнения в истинности устоявшейся теории, рассматривающей клетки Ито исключительно в качестве основных виновников фиброза печени, появились тогда, когда было установлено, что эти клетки продуцируют значительное число морфогенных цитокинов. Среди них значительную группу составляют цитокины, являющиеся потенциальными митогенами для гепатоцитов.

Важнейшим в этой группе является фактор роста гепатоцитов - митоген гепатоцитов , необходимый для пролиферации, выживания и подвижности клеток (он известен также как рассеивающий фактор - scatter factor . Дефект данного фактора роста и (или) его рецептора C-met у мышей приводит к гипоплазии печени и разрушению ее паренхимы в результате подавления пролиферации гепатобластов, усиления апоптоза и недостаточной клеточной адгезии .

Кроме фактора роста гепатоцитов клетки Ито вырабатывают фактор стволовых клеток. Это было показано на модели регенерации печени после частичной гепа-тэктомии и воздействия 2-ацетоаминофлуорена . Также установлено, что клетки Ито секретируют трансформирующий фактор роста-- и эпидермальный фактор роста, которые играют важную роль как в пролиферации гепатоцитов во время регенерации , так и стимулируют митозы самих клеток Ито . Пролиферацию гепатоцитов запускают и экспрессируемые клетками Ито мезенхимальный морфогенный протеин эпиморфин, который появляется в них после частичной гепатэктомии , и плейотрофин .

Кроме паракринных механизмов взаимодействия между гепатоцитами и клетками Ито, определенную роль играют и непосредственные межклеточные контакты этих клеток с гепатоцитами. Важность межклеточных контактов между клетками Ито и эпителиальными клет-ками-предшественниками была показана in vitro, когда культивирование в смешанной культуре оказалось более эффективным для дифференцировки последних в альбумин-продуцирующие гепатоциты, чем культивирование клеток, разделенных мембраной, когда они могли обмениваться только растворимыми факторами через культуральную среду . Выделенные из фетальной печени мыши на 13,5 сут. гестации мезенхимальные клетки с фенотипом Thy-1 +/С049!±/виментин+/десмин+/ --ГМА+ после установления прямых межклеточных контактов стимулировали дифференцировку популяции примитивных печеночных энтодермальных клеток - в гепатоциты (содержащие гликоген, экспрессирующие м-РНК тирозинаминотрансферазы и триптофаноксиге-назы). Популяция Thy-1+/десмин+ мезенхимальных клеток не экспрессировала маркеры гепатоцитов, эндотелия и клеток Купфера, и, по всей видимости, была представлена именно клетками Ито . Высокая плотность десмин-позитивных клеток Ито и их расположение в тесном контакте с дифференцирующимися гепатоцитами отмечены in vivo в пренатальной печени крысы и человека . Таким образом, все эти факты позволяют сделать вывод о том, что данный клеточный тип является важнейшим компонентом микроокружения, необходимым для нормального развития гепатоцитов в онтогенезе и их восстановления в процессе репаративной регенерации.

В последние годы получены данные, свидетельствующие о значительном влиянии клеток Ито на дифференцировку кроветворных стволовых клеток. Так, клетки Ито вырабатывают эритропоэтин и нейротро-фин , оказывающие влияние на дифференцировку не только эпителиальных клеток печени, но и кроветворных стволовых клеток . Изучение фетального гемопоэза крысы и человека показало, что именно эти клетки составляют микроокружение островков кроветворения в печени. Клетки Ито экспрессируют сосудистую молекулу клеточной адгезии (Vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) - ключевую молекулу для поддержания адгезии гемопоэтичес-ких прогенитров к стромальным клеткам костного мозга . Кроме того, они также экспрессируют стромаль-ный фактор-1 - (Stromal derived factor-1 -, SDF-1 -) - потенциальный хемоаттрактант для кроветворных стволовых клеток, стимулирующий их миграцию к месту гемопоэза за счёт взаимодействия со специфическим рецептором Cystein-X-Cystein receptor 4 (CXR4) , а также гомеобоксный протеин Hlx , в случае дефекта которого нарушается как развитие самой печени, так и печеночный гемопоэз . Скорее всего, именно экспрессия VCAM-1 и SDF-1 а на фетальных клетках Ито является триггером для привлечения гемопоэтических клеток-предшественников в фетальную печень для дальнейшей дифференцировки. Ретиноиды, накапливаемые клетками Ито, также являются важным фактором морфогенеза для кроветворных клеток и эпителиев . Нельзя не сказать и о влиянии клеток Ито на мезенхимальные стволовые клетки. Клетки Ито, выделенные из печени крысы и полностью активированные, модулируют дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток (мультипотентных мезенхимальных стромаль-ных клеток) костного мозга в клетки, подобные гепато-цитам (накапливающие гликоген и экспрессирующие тетазу и фосфоэнолпируваткарбоксикиназу) через 2 нед. совместного культивирования .

Таким образом, накопленные научные факты позволяют сделать вывод о том, что клетки Ито являются одним из важнейших клеточных типов, необходимых для развития и регенерации печени. Именно эти клетки создают микроокружение как для фетального печеночного гемопоэза, так и для дифференцировки гепатоцитов в ходе пренатального развития, а также для дифференцировки эпителиальных и мезенхимальных прогениторных клеток в гепатоциты в условиях in vitro. В настоящее время эти данные не вызывает сомнений и признаются всеми исследователями печени. Что же тогда послужило отправной точкой для возникновения гипотезы, вынесенной в название статьи?

В первую очередь, её появлению способствовало выявление в печени клеток, экспрессирующих одновременно как эпителиальные маркеры гепатоцитов, так и мезенхимальные маркеры клеток Ито. Первые работы в этой области были выполнены при изучении пренатального гисто- и органогенеза печени млекопитающих. Именно процесс развития является тем ключевым событием, изучение которого позволяет проследить в естественных условиях динамику первичного становления дефинитивного фенотипа различных клеточных типов органа с помощью специфических маркеров. В настоящее время спектр таких маркеров достаточно широк. В работах, посвященных изучению данного вопроса, были использованы разнообразные маркеры мезенхимальных и эпителиальных клеток, отдельных клеточных популяций печени, стволовых (в том числе и кроветворных) клеток.

В проведенных исследованиях было установлено, что десмин-позитивные клетки Ито плодов крысы транзи-торно на 14-1 5 сут. гестации экспрессируют эпителиальные маркеры, характерные для гепатобластов, такие как цитокератины 8 и 18 . С другой стороны, гепатобласты в эти же сроки развития экспрессируют маркер клеток Ито десмин . Именно это позволило сделать предположение о существовании в печени в период внутриутробного развития клеток с переходным фенотипом, экспрессирующим как мезенхимальные, так и эпителиальные маркеры, и, следовательно, рассматривать возможность развития клеток Ито и гепатоцитов из одного источника и (или) рассматривать эти клетки как один и тот же клеточный тип, находящийся на разных этапах развития. Дальнейшие исследования по изучению гистогенеза, проведенные на материале эмбриональной печени человека, показали, что на 4-8 нед. внутриутробного развития печени человека клетки Ито экспрессировали цитокератины 18 и 19, что было подтверждено двойным иммуногис-тохимическим окрашиванием, а в гепатобластах было отмечено слабое положительное окрашивание на десмин .

Однако в работе, опубликованной в 2000 г. , авторам не удалось выявить в печени плодов мыши экспрессии десмина в гепатобластах, а в клетках Ито - Е-кадгерина и цитокератинов. Авторы получили положительное окрашивание на цитокератины в клетках Ито лишь в небольшой части случаев, что они связали с неспецифическим перекрестным реагированием первичных антител. Выбор же этих антител вызывает некоторое недоумение - в работе были использованы антитела к десмину курицы и цитокератинам 8 и 18 быка.

Кроме десмина и цитокератинов общим маркером для клеток Ито и фетальных гепатобластов мыши и крысы является еще один мезенхимальный маркер - сосудистая молекула клеточной адгезии VCAM-1 . VCAM-1 - это уникальный поверхностный маркер, позволяющий отличать клетки Ито от миофибробластов во взрослой печени крысы и присутствующий также на некоторых других клетках печени мезенхимального происхождения - таких, как эндотелиоциты или миогенные клетки .

Еще одним свидетельством в пользу рассматриваемой гипотезы является возможность мезенхимально-эпителиальной трансдифференцировки (конверсии) клеток Ито, выделенных из печени взрослых крыс . Необходимо отметить, что в литературе обсуждается в основном эпителиально-мезенхимальная, а не мезенхимально-эпителиальная трансдифференцировка, хотя оба направления признаются возможными, и нередко сам термин «эпителиально-мезенхимальная трансдифференцировка» применяется для обозначения трансдифференцировки в любом из направлений . Проанализировав профиль экспрессии м-РНК и соответствующих белков в клетках Ито, выделенных из печени взрослых крыс после воздействия четырёххлористого углерода (ЧХУ), авторы обнаружили в них как мезенхимальные, так и эпителиальные маркеры. Среди мезенхимальных маркеров были выявлены нестин, --ГМА, матриксная металлопротеиназа-2 (Matrix Metalloproteinase-2, ММР-2), а среди эпителиальных - мышечная пируват-киназа (Muscle pyruvate kinase, МРК), характерная для овальных клеток , цитокератин 19, а-ФП, Е-кадге-рин, а также транскрипционный фактор Hepatocyte nuclear factor 4- (HNF-4-), специфический для клеток, которым суждено стать гепатоцитами. Также было установлено, что в первичной культуре эпителиальных печеночных прогениторных клеток человека происходит экспрессия м-РНК маркеров клеток Ито - нестина, GFAP - эпителиальные прогениторы коэкспрессируют как эпителиальные, так и мезенхимальные маркеры. Возможность же мезенхимально-эпителиальной трансдифференцировки подтверждается появлением в клетках Ито Integrin-linked kinase (ILK) - фермента, необходимого для такой трансдифференцировки .

Мезенхимально-эпителиальная трансдифференцировка была выявлена и в наших экспериментах in vitro , где был предпринят оригинальный подход к культивированию чистой популяции клеток Ито, выделенных из печени крысы, до образования плотного монослоя клеток. После этого клетки прекращали экспрессировать десмин и другие мезенхимальные маркеры, приобретали морфологию эпителиальных клеток и начинали экспрессировать маркеры, характерные для гепатоцитов, в частности, цитокератины 8 и 18 . Подобные результаты были получены и при органотипическом культивировании эмбриональной печени крыс .

В течение последнего года были опубликованы две статьи, в которых клетки Ито рассматриваются как подтип овальных клеток, или как их производные . Овальные клетки - мелкие клетки овальной формы с узким ободком цитоплазмы, которые появляются в печени на некоторых моделях токсического повреждения печени и в настоящее время рассматриваются как би-потентные клетки-предшественники, способные дифференцироваться как в гепатоциты, так и в холангиоциты . Исходя из того, что гены, которые экспрессируются выделенными клетками Ито, совпадают с генами, экспрессируемыми овальными клетками, а при определённых условиях культивирования клеток Ито появляются гепатоциты и клетки желчных протоков, авторы проверяли гипотезу, согласно которой клетки Ито - это тип овальных клеток, способных генерировать гепатоциты для регенерации поврежденной печени . Трансгенные GFAP-Cre/GFP (Green fluorescent protein) мыши находились на метионин холин-дефицитной/этионин-обо-гащенной диете для активации клеток Ито и овальных клеток. Покоящиеся клетки Ито имели GFAP+ фенотип. После активации клеток Ито повреждением или культивированием экспрессия GFAP в них снижалась и они начинали экспрессировать маркеры овальных и мезенхимальных клеток. Овальные клетки исчезали, когда появлялись GFP+ гепатоциты, начинающие экспрессировать альбумин и, в конечном счете, замещающие большие области печеночной паренхимы. На основании полученных данных авторы высказали предположение, что клетки Ито представляют собой подтип овальных клеток, которые дифференцируются в гепатоциты через «мезенхимальную» фазу.

В экспериментах, выполненных на этой же модели активации овальных клеток, когда последние были выделены из печени крыс, было установлено, что овальные клетки in vitro экспрессируют не только традиционные для них маркеры 0V-6, BD-1/BD-2 и М2РК и маркеры елки экстрацеллюлярного матрикса, включая коллагены, матриксные металлопротеиназы и тканевые ингибиторы металлопротеиназ - маркерные признаки клеток Ито . После воздействия на клетки TGF-pl помимо подавления роста и морфологических изменений было отмечено усиление экспрессии этих генов, а также генов десмина и GFAP, появление экспрессии транскрипционного фактора Snail, отвечающего за эпителиально-мезенхимальную трансдифференцировку , и прекращение экспрессии Е-кадгерина , что свидетельствует о возможности «обратной» трансдифференцировки овальных клеток в клетки Ито.

Поскольку овальные клетки традиционно рассматриваются как бипотентные предшественники и гепатоцитов, и холангиоцитов, были предприняты попытки установить возможность существования переходных форм между эпителиальными клетками внутрипеченочных желчных протоков и клетками Ито. Так, было показано, что в нормальной и поврежденной печени мелкие структуры протокового типа окрашивались позитивно на маркер клеток Ито --ГМА , однако на представленных в статье фотографиях, где отражены результаты иммунофлуо-ресцентного окрашивания, определить, что в действительности представляют собой эти --ГМА+ протоковые структуры - желчные протоки или кровеносные сосуды - не представляется возможным. Однако были опубликованы и другие результаты, свидетельствующие об экспрессии маркеров клеток Ито в холангиоцитах. В уже упомянутой работе L. Yang была показана экспрессия маркера клеток Ито GFAP клетками желчных протоков. Белок промежуточных филаментов цитоскелета синемин, присутствующий в нормальной печени в клетках Ито и клетках сосудов, при развитии дуктулярной реакции появлялся в вовлеченных в нее протоковых клетках; он также экспрессировался в клетках холанги-окарциномы . Таким образом, если в отношении возможности взаимной трансдифференцировки клеток Ито и гепатоцитов разнообразных свидетельств достаточно много, то с холангиоцитами пока еще подобные наблюдения единичны и не всегда однозначны.

Подводя итог, можно сказать, что закономерности экспрессии мезенхимальных и эпителиальных маркеров как в ходе гисто- и органогенеза печени, так и в разнообразных экспериментальных условиях как in vivo, так и in vitro свидетельствуют о возможности как мезенхимально-эпителиальных, так и эпителио-мезенхи-мальных переходов между клетками Ито/овальными клетками/гепатоцитами, а следовательно, позволяют рассматривать клетки Ито как один из источников развития гепатоцитов. Приведенные факты, несомненно, указывают на неразрывную связь между данными клеточными типами, а также свидетельствует о значительной фенотипической пластичности клеток Ито. О феноменальной пластичности этих клеток свидетельствует и экспрессия ими ряда нейральных протеинов, таких как уже упомянутые GFAP, нестин, нейротрофины и рецепторы к ним, нейрональная молекула клеточной адгезии (Neural cell adhesion molecule, N-CAM), синаптофизин, фактор роста нервов (Neural growth factor, NGF), мозговой нейротрофический фактор (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) , на основании чего рядом авторов обсуждается возможность развития клеток Ито из нервного гребня . Однако последнее десятилетие огромное внимание исследователей привлекает другая версия - а именно - возможность развития гепатоцитов и клеток Ито из кроветворных и мезенхимальных стволовых клеток.

Первая работа, в которой была доказана такая возможность, опубликована В.Е. Petersen с соавт., которые показали, что гепатоциты способны развиваться из кроветворной стволовой клетки . В последующем этот факт был неоднократно подтвержден в работах других ученых , а немного позднее возможность дифференцировки в гепатоциты была показана и для мезенхимальной стволовой клетки . Каким образом это происходит - путем слияния донорских клеток с клетками печени реципиента, или путем их трансдифференцировки - до сих пор не ясно. Однако мы также установили, что кроветворные стволовые клетки пуповинной крови человека при трансплантации в селезенку крысам, перенесшим частичную гепатэктомию, заселяются в печень и способны дифференцироваться в гепатоциты и в синусоидные клетки печени, о чем свидетельствует присутствие в этих клеточных типах маркеров клеток человека . Кроме того, нами впервые было показано, что предварительная генетическая модифи-цикация клеток пуповинной крови не оказывает существенного влияния на их распределение и возможности дифференцировки в печени реципиента после трансплантации . Что касается вероятности развития гепатоцитов из кроветворных стволовых клеток в ходе пренатального гистогенеза - то хотя такую возможность нельзя исключить полностью, но она, тем не менее, кажется маловероятной, поскольку морфология, локализация и фенотип этих клеток существенно отличаются от аналогичных показателей для клеток печени. По-видимому, если такой путь и существует, он не играет значительной роли в становлении эпителиальных и синусоидных клеток в ходе онтогенеза . Результаты исследований последних лет, проведенных как in vivo, так и in vitro, поставили под сомнение устоявшуюся теорию развития гепатоцитов только из энтодермального эпителия передней кишки , в связи с чем закономерно возникло предположение, что региональная стволовая клетка печени может находится среди её мезенхимальных клеток. Могут ли такими клетками быть клетки Ито?

Учитывая уникальные свойства этих клеток, их феноменальную пластичность и существование клеток с переходным фенотипом от клеток Ито к гепатоцитам, мы предполагаем, что именно эти клетки являются основными претендентами на эту роль. Дополнительными аргументами в пользу такой возможности становится то, что эти клетки, так же как гепатоциты, могут образовываться из кроветворных стволовых клеток, и именно они - единственные из синусоидных клеток печени - способны экспрессировать маркеры стволовых (проге-ниторных) клеток.

В 2004 г. было установлено, что клетки Ито также могут развиваться из кроветворной стволовой клетки . После трансплантации клеток костного мозга GFP-мышей в печени мышей-реципиентов появлялись GFP+ клетки, экспрессировавшие маркер клеток Ито GFAP, а отростки этих клеток проникали между гепатоцитами. В случае, если печень реципиента была повреждена ЧХУ, трансплантированные клетки экспрессировали также - бластоподобных клеток Ито. При выделении из печени мышей-реципиентов фракции непаренхиматозных клеток, GFP+ клетки с липидными каплями составили 33,4+2,3% от изолированных клеток; они экспрессировали десмин и GFAP, а через 7 сут. культивирования

С другой стороны, трансплантация клеток костного мозга приводит к образованию не только клеток Ито, но ген коллагена I типа, на основании чего был сделан вывод о том, что такая трансплантация способствует развитию фиброза . Однако существуют и работы, где было продемонстрировано уменьшение фиброза печени за счет миграции трансплантированных клеток в фиброзные септы и продукции этими клетками матрик-сной металлопротеиназы-9 (Matrix Metalloproteinase-9, ММР-9) , которая является одним из важнейших признаков клеток Ито . Наши предварительные данные также показали уменьшение числа миофиброблас-тов и снижение уровня фиброза после аутотрансплантации фракции мононуклеаров периферической крови больным хроническими гепатитами с тяжелым фиброзом печени . Кроме того, в результате трансплантации кроветворных стволовых клеток в печени реципиента могут появляться и другие клеточные типы, способные продуцировать внеклеточный матрикс. Так, при повреждении печени, индуцированном перевязкой желчного протока, трансплантированные клетки дифференциро-фиброцитов, экспрессирующих коллаген, и только при культивировании в присутствии TGF-pl они дифферен-миофибробласты, потенциально способствующие фиброзу. Таким образом, опасность фиброзирования печени после трансплантации клеток костного мозга авторы связали не с клетками Ито, а с «уникальной популяцией фиброцитов» . В связи с противоречивостью полученных данных дискуссия развернулась еще по одному вопросу - будут ли клетки Ито, появившиеся в результате дифференцировки трансплантированных кроветворных стволовых клеток, способствовать развитию фиброза, или же они обеспечат полноценную регенерацию ткани печени и редукцию фиброза. В последние годы становится очевидно (в том числе и из приведенных выше данных), что происхождение миофибробластов в печени может быть различным - из клеток Ито, из фиброб-ластов портальных трактов, и даже из гепатоцитов . Установлено также, что миофибробласты различного происхождения отличаются по целому ряду свойств. Так, активированные клетки Ито отличаются от миофибробластов портальных трактов по содержанию витаминов, контрактильной активности, ответу на цитокины, особенно на TGF-p, способности к спонтанному апоптозу . Кроме того, эти популяции клеток отличаются и по возможности экспрессировать сосудистую молекулу клеточной адгезии VCAM-1, которая присутствует на клетках Ито и отсутствует на миофибробластах . Нельзя не сказать и о том, что помимо продукции белков межклеточного матрикса активированные клетки Ито вырабатывают также матриксные металлопротеиназы, этот матрикс разрушающие . Таким образом, роль клеток Ито, в том числе и образовавшихся из кроветворных стволовых клеток, в развитии фиброза далеко не так однозначна, как считалось ранее. По-видимому, они не столько способствуют фиброзу, сколько ремоделируют межклеточный матрикс в процессе восстановления печени после повреждения, обеспечивая, таким образом, соединительнотканный каркас для регенерации паренхиматозных клеток печени .

нормальной, так и поврежденной печени крыс. Клетки Ито крысы экспрессируют также другой маркер стволовых (прогениторных) клеток - CD133, и демонстрируют свойства прогениторных клеток, способных, в зависимости от условий, дифференцироваться в различных - 2) при добавлении облегчающих дифференцировку в эндотелиальные клетки цитокинов формировать разветвленные трубчатые структуры с индукцией экспрессии маркеров эндотелиальных клеток - эндотелиальной N0-синтазы и сосудисто-эндотелиального кадгерина; 3) при использовании цитокинов, способствующих дифферен-цировке стволовых клеток в гепатоциты - в округлые клетки, экспрессирующие маркеры гепатоцитов -ФП и альбумин . Также клетки Ито крысы экспрессируют 0ct4, характерный для плюрипотентных стволовых клеток . Интересно, что только часть популяции клеток Ито может быть выделена магнитным сортером с помощью антител к CD133, однако после стандартного (проназа/коллагеназа) выделения все прикрепившиеся к пластику клетки экспрессировали CD133 и 0kt4 . Еще один маркер для прогениторных клеток - Bcl-2 экспрессируется десмин+ клетками в ходе пренатального развития печени человека .

Таким образом, разными исследователями показана возможность экспрессии клетками Ито тех или иных маркеров стволовых (прогениторных) клеток. Более того, совсем недавно опубликована статья, в которой впервые высказана гипотеза о том, что пространство Дис-се, образованное протеинами базальной мембраны, эндотелиальными клетками и гепатоцитами, в котором располагаются клетки Ито, может составлять микроокружение для последних, выполняя роль «ниши» стволовых клеток. Об этом свидетельствуют сразу несколько признаков, характерных для ниши столовых клеток и выявленных у компонентов микроокружения клеток Ито. Так, клетки, расположенные в непосредственной близости к стволовой, должны вырабатывать растворимые факторы, а также осуществлять прямые взаимодействия, сохраняющие стволовую клетку в недифференцированном состоянии и задерживающие ее в нише, часто расположенной на базальной мембране . И действительно, эндотелиальные клетки синусоидных капилляров печени синтезируют растворимый SDF-1, связывающийся специфически с рецептором клеток Ито CXR4 и стимулирующий миграцию этих клеток in vitro . Это взаимодействие играет ключевую роль в миграции гемопоэтических стволовых клеток к своей окончательной нише в костном мозге в ходе онтогенеза и постоянному пребыванию в ней , а также в их мобилизации в периферическую кровь . Логично предположить, что похожую роль такое взаимодействие может играть и в печени, удерживая клетки Ито в пространстве Диссе. Во время ранних этапов регенерации печени усиление экспрессии SDF-1 может способствовать также привлечению дополнительных компартмен-тов стволовых клеток организма . В иннервации клеток ниши должна участвовать симпатическая нервная система, вовлеченная в регуляцию привлечения стволовых кроветворных клеток . Норадренергические сигналы симпатической нервной системы играют критическую роль в GCSF (Granulocyte colony-stimulating factorl-индуцированной мобилизации гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга . Расположение нервных окончаний в непосредственной близости от клеток Ито было подтверждено в нескольких работах . Также установлено, что в ответ на симпатическую стимуляцию клетки Ито секретируют простагландины F2a и D, активирующие гликогенолиз в ближайших паренхиматозных клетках . Эти факты свидетельствуют о том, что симпатическая нервная система может иметь влияние на нишу клеток Ито. Еще одной функцией ниши стволовых клеток является подержание «медленного» клеточного цикла и недифференцированного состояния стволовых клеток. Поддержанию недифференцированного состояния клеток Ито в условиях in vitro способствуют паренхиматозные клетки печени - при культивировании этих двух популяций клеток, разделенных мембраной, в клетках Ито сохраняется экспрессия маркеров стволовых клеток CD133 и 0kt4, тогда как в отсутствие гепатоцитов клетки Ито приобретают фенотип миофиб-робластов и теряют маркеры стволовых клеток. Таким образом, экспрессия маркеров стволовых клеток, несомненно, признак покоящихся клеток Ито. Установлено также, что в основе влияния паренхиматозных клеток на клетки Ито может лежать взаимодействие синтезируемых гепатоцитами паракринных факторов Wnt и Jag1 с соответствующими рецепторами (Мус, Notchl) на поверхности клеток Ито . Wnt/b-catenin и Notch сигнальные пути поддерживают способность стволовых клеток к самообновлению путем медленного симметричного деления без последующей дифференцировки . Еще одним важным компонентом ниши являются белки базальной мембраны, ламинин и коллаген IV, поддерживающие покоящееся состояние клеток Ито и подавляющие их дифференцировку. Похожая ситуация имеет место в мышечных волокнах и извитых семенных канальцах, где клетки-сателлиты (стволовые клетки мышечной ткани) и недифференцированные сперматогонии находятся в тесном контакте с базальной мембраной соответственно мышечного волокна или «сперматогенного эпителия» . Очевидно, что взаимодействие стволовых клеток с протеинами внеклеточного матрикса подавляет запуск их окончательной дифференцировки . Полученные данные, таким образом, позволяют рассматривать клетки Ито как стволовые клетки, нишей для которых может служить пространство Диссе.

Наши данные о стволовых потенциях клеток Ито и о возможности образования гепатоцитов из этих клеток были подтверждены в экспериментах по изучению регенерации печени in vivo на моделях частичной гепатэктомии и токсического повреждения печени нитратом свинца . Традиционно считается, что в этих моделях регенерации печени не происходит активации стволового компартмен-та и овальные клетки отсутствуют . Нам удалось установить, однако, что в обоих случаях можно наблюдать не просто активацию клеток Ито, а и экспрессию в них еще одного маркера стволовых клеток, а именно - рецептора к фактору стволовых клеток C-kit . Поскольку экспрессия C-kit также была отмечена в единичных гепатоцитах (в них она была менее интенсивной), в основном расположенных в контакте с C-kit-позитивными клетками Ито, можно предположить, что эти гепатоциты дифференцировались из C-kit+ клеток Ито. Очевидно, что данный клеточный тип не только создает условия для восстановления популяции гепатоцитов, но и сам занимает нишу стволовых региональных клеток печени.

Таким образом, в настоящее время установлено, что клетки Ито экспрессируют как минимум пять маркеров стволовых клеток в различных условиях развития, регенерации и культивирования. Все накопленные на сегодняшний день данные позволяют предположить, что клетки Ито могут выполнять роль региональных стволовых клеток печени, являясь одним из источников развития гепатоцитов (а возможно, и холангиоцитов), а также являются важнейшим для морфогенеза печени и печеночного гемопоэза компонентом микроокружения. Тем не менее, однозначные выводы о принадлежности этих клеток к популяции стволовых (прогениторных) клеток печени, по-видимому, делать несколько преждевременно. Однако очевидна необходимость проведения новых исследований в этом направлении, которые, в случае успеха, откроют перспективы для разработки эффективных методов лечения заболеваний печени, основанных на трансплантации стволовых клеток.

Ключевые слова

ПЕЧЕНЬ / ЗВЕЗДЧАТЫЕ КЛЕТКИ ИТО / МОРФОЛОГИЯ / ХАРАКТЕРИСТИКА / ВИТАМИН А / ФИБРОЗ / LIVER / HEPATIC STELLATE CELLS / MORPHOLOGY / CHARACTERISTIC / VITAMIN A / FIBROSIS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы - Цыркунов В.М., Андреев В.П., Кравчук Р.И., Кондратович И.А.

Введение. Роль звездчатых клеток Ито (ЗКИ) определена как одна из ведущих в развитии фиброза в печени , однако прижизненная визуализация структуры ЗКИ в клинической практике использована минимально. Цель работы: представить структурно-функциональную характеристику ЗКИ по результатам цитологической идентификации прижизненных биоптатов печени . Материалы и методы. Применены классические методы световой и электронной микроскопии биоптатов и оригинальные методики с использованием ультратонких срезов, фиксации и окраски. Результаты. На фотоиллюстрациях световой и электронной микроскопии биоптатов печени пациентов с хроническим гепатитом С представлены структурные характеристики ЗКИ, находящихся на разных стадиях (покоя, активации) и в процессе трансформации в миофибробласты. Выводы. Применение оригинальных методов клинической морфологической идентификации и оценки функционального состояния ЗКИ повысит качество диагностики и прогнозирования фиброза печени .

Текст научной работы на тему «Клиническая Цитология печени: звездчатые клетки Ито»

УДК 616.36-076.5

КЛИНИЧЕСКАЯ ЦИТОЛОГИЯ ПЕЧЕНИ: ЗВЕЗДЧАТЫЕ КЛЕТКИ ИТО

Цыркунов В. М. ([email protected]), Андреев В. П. ([email protected]), Кравчук Р. И. ([email protected]), Кондратович И. А. ([email protected]) УО «Гродненский государственный медицинский университет», Гродно, Беларусь

Цель работы: представить структурно-функциональную характеристику ЗКИ по результатам цитологической идентификации прижизненных биоптатов печени.

Материалы и методы. Применены классические методы световой и электронной микроскопии биопта-тов и оригинальные методики с использованием ультратонких срезов, фиксации и окраски.

Результаты. На фотоиллюстрациях световой и электронной микроскопии биоптатов печени пациентов с хроническим гепатитом С представлены структурные характеристики ЗКИ, находящихся на разных стадиях (покоя, активации) и в процессе трансформации в миофибробласты.

Выводы. Применение оригинальных методов клинической морфологической идентификации и оценки функционального состояния ЗКИ повысит качество диагностики и прогнозирования фиброза печени.

Ключевые слова: печень, звездчатые клетки Ито, морфология, характеристика, витамин А, фиброз.

Введение

Неблагоприятным исходом большинства хронических диффузных поражений печени разной этиологии, включая хронический гепатит С (ХГС), является фиброз печени, в развитии которого главными участниками являются активированные фибробласты, основным источником которых являются активированные звездчатые клетки Ито (ЗКИ) .

ЗКИ, синоним - звёздчатые клетки печени, жирозапасающие клетки, перисинусоидальные липоциты, стеллатные клетки (англ. Hepatic Stellate Cell, HSC, Cell of Ito, Ito cell). ЗКИ впервые были описаны в 1876 г. К. Купффером и названы им звёздчатыми клетками («Stemzellen»). Т. Ито (T.Ito), обнаружив в них капли жира, обозначил их вначале жиропоглощающими («shibo-sesshusaibo»), а затем, установив, что жир вырабатывался самими клетками из гликогена, - жирозапасающими клетками («shibo-chozosaibo») . В 1971 г. К. Вакэ (K.Wake) доказал идентичность звездчатых клеток Купф-фера и жирозапасающих клеток Ито и то, что эти клетки «складируют» витамин А .

Около 80% витамина А, находящегося в организме, накапливается в печени, и до 80% всех ретиноидов печени депонировано в жировых каплях ЗКИ. Эфиры ретинола в составе хиломи-кронов попадают в гепатоциты, где конвертируются в ретинол, образуя комплекс витамина А с ретинолсвязывающим белком (РСБ), который секретируется в перисинусоидальное пространство, откуда депонируется клетками .

Установленная К. Поппером тесная связь ЗКИ с фиброзом печени продемонстрировала их не статичную, а динамичную функцию - способность непосредственно участвовать в ремо-делировании внутридолькового перигепатоцел-люлярного матрикса .

Основным методом морфологического исследования печени, проводимого по оценке изменений в прижизненных биоптатах, является световая микроскопия, которая в клинической практике позволяет установить активность вос-

паления и стадию хронизации . Недостатком метода является малое разрешение, не позволяющее оценить особенности строения клеток, внутриклеточных органелл, включений, функциональные характеристики. Прижизненное электронно-микроскопическое исследование ультраструктурных изменений в печени дает возможность дополнить данные световой микроскопии и повысить их диагностическую ценность.

В связи с этим идентификация ЗКИ печени, изучение их фенотипа в процессе трансдиффе-ренцировки, определение интенсивности их пролиферации являются важнейшим вкладом в прогнозирование исходов болезней печени, а также в патоморфологию и патофизиологию фиброгенеза.

Цель - представить структурно-функциональную характеристику ЗКИ по результатам цитологической идентификации прижизненных биоптатов печени.

Материалы и методы

Прижизненный биоптат печени получен проведением аспирационной биопсии печени у пациентов с ХГС (РНК HCV+), от которых получено письменное информированное согласие.

Для световой микроскопии полутонких срезов образцы биоптата печени пациентов размером 0,5^2 мм фиксировали методом двойной фиксации: вначале - по методике Sato Taizan , затем образцы ткани в течение 1 часа дополнительно фиксировали в 1% осмиевом фиксаторе, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере Зёренсена, рН 7,4. Для лучшего выявления внутриклеточных структур и межуточного вещества на полутонких срезах в 1% четырехокись осмия добавляли дихромат калия (К2Сг207) или кристаллы хромового ангидрида (1 мг/мл). После дегидратации образцов в серии спиртовых растворов возрастающей концентрации и ацетоне они помещались в преполимеризован-ную смесь бутилового метакрилата и стирола и полимеризовались при 550С. Полутонкие срезы (толщиной 1 мкм) последовательно окрашивали

азур II-основным фуксином. Микрофотографии получали с использованием цифровой видеокамеры (Leica FC 320, Германия).

Электронно-микроскопическое изучение проводили в образцах биоптатов печени размером 0,5x1,0 мм, фиксированных 1% раствором четырехокиси осмия на 0,1 М буфере Миллони-га, рН 7,4, при +40С в течение 2 часов . После дегидратации в спиртах восходящей концентрации и ацетоне образцы заливали в аралдит . Из полученных блоков на ультрамикротоме Leica EM VC7 (Германия) готовили полутонкие срезы (400 нм) и окрашивали метиленовым синим. Препараты просматривали в световом микроскопе и выбирали однотипный участок для дальнейшего изучения ультраструктурных изменений. Ультратонкие срезы (35 нм) контрастировали 2% раствором уранилацетата на 50% метаноле и цитратом свинца по E. S. Reynolds . Электронно-микроскопические препараты изучали в электронном микроскопе JEM-1011 (JEOL, Япония) при увеличениях 10 000-60 000 при ускоряющем напряжении 80 кВт. Для получения снимков использовался комплекс из цифровой камеры Olympus MegaViewIII (Германия) и программы для обработки изображений iTEM (Olympus, Германия).

Результаты и обсуждение

ЗКИ располагаются в перисинусоидальном пространстве (Диссе) в карманах между гепа-тоцитами и эндотелиальными клетками, имеют длинные отростки, проникающие глубоко между гепатоцитами. В большинстве публикаций, посвященных данной популяции ЗКИ, приводится их схематическое изображение, позволяющее только обозначить «территориальную» принадлежность ЗКИ в печени и по отношению к окружающим их «соседям» (рисунок 1).

ЗКИ имеют тесный контакт с эндотелиоцита-ми через компоненты неполной базальной мембраны и интерстициальные коллагеновые волокна. Нервные окончания проникают между ЗКИ и паренхиматозными клетками, из-за чего пространство Диссе определяют как пространство между пластинками паренхиматозных клеток и

комплексом ЗКИ и эндотелиальных клеток .

Полагают, что ЗКИ происходят из слабо-дифференцированных мезенхимных клеток поперечной перегородки развивающейся печени . В эксперименте установлено, что в образовании ЗКИ участвуют гемопоэтические стволовые клетки и что этот процесс не обусловлен слиянием клеток .

Синусоидальные клетки (СК), прежде всего ЗКИ, при всех видах регенерации печени играют ведущую роль. Фиброзирующая регенерация печени происходит в результате ингибирова-ния стволовых функций ЗКИ и стволовых клеток костного мозга . В печени человека ЗКИ составляют 5-15%, являясь одной из 4-х разновидностей СК, имеющих мезенхимальное происхождение: клетки Купффера, эндотелиоциты, Рй-клетки. В составе пула СК обнаруживается также 20-25% лейкоцитов .

В цитоплазме ЗКИ находятся жировые включения с ретинолом, триглицериды, фосфолипи-ды, холестерин, свободные жирные кислоты, а-актин и десмин . Для визуализации ЗКИ применяется окрашивание хлоридом золота. В эксперименте установлено, что маркером дифференциации ЗКИ от других миофибробластов является экспрессия ими белка рилин .

ЗКИ существуют в спокойном («неактивные ЗКИ»), переходном и длительно активированном состоянии, каждое из которых характеризуется экспрессией генов и фенотипом (а^МА, 1САМ-1, хемокины и цитокины).

ЗКИ в неактивном состоянии имеют округлую, слегка вытянутую или неправильную форму, крупное ядро и яркий визуализационный признак - липидные включения (капли), содержащие ретинол (рисунок 2).

Количество липидных капель в неактивной ЗКИ достигает 30 и более, они близки по размеру, прилежат друг к другу, вдавливаясь в ядро и оттесняя его к периферии (рисунок 2). Между большими каплями могут располагаться мелкие включения. Цвет капель зависит от фиксатора и окраски материала. В одном случае они светлые (рисунок 2а), в другом - темно зеленые (рисунок 2б).

Рисунок 1. - Схема расположения ЗКИ (stellatecell, перисинусоидальный липоцит) в перисинусоидальном пространстве Диссе (space of Disse), Интернет-ресурс

Рисунок 2. - ЗКИ, находящиеся в неактивном состоянии

а - ЗКИ округлой формы с большим содержанием ли-пидных капель со светлой окраской (белые стрелки), гепатоциты (Гц) с опустошенной цитоплазмой (черная стрелка); б - ЗКИ с липидными каплями темной окраски, в тесном контакте с макрофагом (Мф); а-б - полутонкие срезы. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотографии. Увел. 1000; в - ЗКИ с обилием липидных капель (более 30), имеющая неправильную форму (ув. 6 000); г-ультраструктурныекомпонентыЗКИ:л-липидныекапли, митохондрии (оранжевые стрелки), ГрЭС (зеленые стрелки), комплекс Гольджи (красная стрелка), ув. 15 000; в-г - электронограммы

При электронной микроскопии на фоне светлого липидного субстрата формируется более осмиофильный маргинальный ободок (рисунок 5а) . У большинства «покоящихся» ЗКИ наряду с крупными липидными включениями заметно малое количество цитоплазматического матрикса, бедного митохондриями (Мх) и гранулярной эндоплазматической сетью (ГрЭС). При этом отчетливо видны компартменты умеренно развитого комплекса Гольджи в виде стопки из 3-4 уплощенных цистерн со слегка расширенными концами (рисунок 2г).

При определенных условиях активирующиеся ЗКИ приобретают смешанный, или переходный фенотип, сочетающий морфологические признаки и липидосодержащей, и фибробласто-подобной клетки (рисунок 3).

Переходный фенотип ЗКИ также имеет свои морфологические признаки. Клетка приобретает вытянутую форму, количество липидных включений уменьшается, происходит сокращение числа инвагинаций нуклеолеммы. Увеличивается объем цитоплазмы, содержащей многочисленные цистерны ГрЭС со связанными рибосомами и свободные рибосомы, Мх. Наблюдается гиперплазия компонентов пластинчатого комплекса Гольджи, представленного несколькими стопками из 3-8 уплощенных цистерн, возрастает численность лизосом, участвующих в деграда-

Рисунок 3. - ЗКИ, находящиеся в переходном состоянии

а - ЗКИ (белые стрелки). Полутонкий срез. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотография. Увел. 1000; б - ЗКИ удлиненной формы и с малым количеством липид-ных капель; ув. 8 000; в - ЗКИ в контакте с клетками Куп-ффера (КК) и лимфоцитом (Лц), ув. 6 000. (Гц - гепатоцит, л - липидные капли, Э - эритроцит); г - митохондрии (оранжевые стрелки), ГрЭС (зеленые стрелки), к. Гольд-жи (красная стрелка), лизосомы (синие стрелки), ув.20 000; б, в, г - электронограммы

ции липидных капель (рисунок 3г). Гиперплазия компонентов ГрЭС и комплекса Гольджи связана со способностью фибробластов синтезировать молекулы коллагена, а также моделировать их путем посттрансляционного гидроксилирова-ния и гликозилирования в эндоплазматическом ретикулуме и элементах комплекса Гольджи.

В неповрежденной печени ЗКИ, находясь в спокойном состоянии, охватывают своими отростками синусоидный капилляр. Отростки ЗКИ подразделяются на 2 типа: перисинусоидальные (субэндотелиальные) и интергепатоцеллюляр-ные (рисунок 4).

Первые выходят из тела клетки и простираются вдоль поверхности синусоидного капилляра, охватывая его тонкими пальцеобразными ответвлениями. Они покрыты короткими ворсинками, имеют характерные длинные микровыбросы, простирающиеся еще дальше по поверхности эндотелиальной трубки капилляра. Интергепа-тоцеллюлярные выросты, преодолев пластинку гепатоцитов и достигнув соседнего синусоида, делятся на несколько перисинусоидальных выростов. Таким образом, ЗКИ в среднем охватывает больше двух соседних синусоидов .

При поражениях печени происходит активация ЗКИ и процесса фиброгенеза, в котором выделяют 3 фазы. Они обозначаются как инициация, пролонгация и резолюция (разрешение фиброзной ткани) . Этот процесс трансформации «покоящихся» ЗКИ в фиброзирующие миофи-бробласты инициируется цитокинами (^-1, ^-6,

Рисунок 4. - Перисинусоидальные (субэндотелиальные) и интергепатоцеллюлярные отростки (выросты) ЗКИ

а - отросток ЗКИ (желтые стрелки), выходящий из тела клетки, ув. 30 000; б - отросток ЗКИ, расположенный вдоль поверхности синусоидного капилляра, содержащий липидную каплю, ув. 30 000; в - субэндотелиально расположенные отростки ЗКИ. Отростки эндотелиальных клеток (розовые стрелки); г - интергепатоцеллюлярный отросток ЗКИ; участок деструкции мембран ЗКИ и гепа-тоцита (черные стрелки), ув. 10 000. Электронограммы

ТОТ-а), недоокисленными продуктами метаболизма, активными формами кислорода, оксидом азота, эндотелином, тромбоцитактивирующим фактором (PDGF), активатором плазминогена, трансформирующим фактором роста (TGF-1), ацетальдегидом и многими другими. Непосредственными активаторами являются гепатоци-ты в состоянии окислительного стресса, клетки Купффера, эндотелиоциты, лейкоциты, тромбоциты, продуцирующие цитокины (паракринные сигналы) и сами ЗКИ (аутокринная стимуляция). Активация сопровождается экспрессией (включением в работу) новых генов, синтезом цито-кинов и белков экстрацеллюлярного матрикса (коллагенов I, Ш,У типаов) .

На данном этапе процесс активации ЗКИ может завершиться за счет стимуляции образования в ЗКИ противовоспалительных цитокинов, ингибирующих продукцию ТОТ-а макрофагами в зоне повреждения. В результате количество ЗКИ резко сокращается, они подвергаются апоп-тозу и процессы фиброза в печени не развиваются .

Во вторую фазу (пролонгированную) при продолжительном постоянном паракринном и аутокринном воздействии активирующих стимулов в ЗКИ «поддерживается» активированный фенотип, характеризующийся превращением ЗКИ в контрактильные миофибробластоподоб-ные клетки, осуществляющие синтез экстрацел-люлярного фибриллярного коллагена.

Активированный фенотип характеризуется пролиферацией, хемотаксисом, сокращаемостью, потерей запасов ретиноида и образованием клеток, напоминающих миофибробластные . Активированные ЗКИ также демонстрируют повышенное содержание новых генов, таких как a-SMA, ICAM-1, хемокины и цитокины. Активация клеток свидетельствует о начале ранней стадии фиброгенеза и предшествует повышенному продуцированию ECM-белков . Образовавшиеся фиброзные ткани подвергаются ремоделированию за счет расщепления матрик-са с помощью матриксных металлопротеиназ (matrixmetaloproteinases - MMPs). В свою очередь расщепление матрикса регулируется тканевыми ингибиторами MMPs (tissue inhibitors of matrixmetaloproteinases - TIMPs). MMPs и TIMPs входят в семейство цинкозависимых ферментов. MMPs синтезируются в ЗКИ в виде неактивных проферментов, которые активируются при отщеплении пропептида, но ингибируются при взаимодействии с эндогенными TIMPs - TIMPs-1 и TIMPs-2. ЗКИ продуцируют 4 типа MMPs мембранного типа, которые активируются под воздействием IL-1 р. Среди MMPs особое значение придается MMPs-9 - нейтральной матриксной металлопротеиназе, которая обладает активностью против коллагена 4-го типа, входящего в состав базальной мембраны, а также против частично денатурированных коллагенов 1-го и 5-го типов .

Об увеличении популяции ЗКИ при разного рода повреждениях печени судят по активности значительного числа митогенных факторов, родственных им тирозинкиназных рецепторов и других идентифицированных митогенов, которые вызывают наиболее выраженную пролиферацию ЗКИ: эндотелин-1, тромбин, FGF - фактор роста фибробластов, PDGF - фактор роста эндотелия сосудов, IGF - инсулиноподобный фактор роста. Накопление ЗКИ в зонах повреждения печени происходит не только за счет пролиферации этих клеток, но и за счет их направленной миграции в эти зоны путем хемотаксиса, при участии таких хемоаттрактантов, как PDGF и лейкоцитарный хемоаттрактант-MCP (моно-цитарный хемотаксический протеин-1) .

У активированных ЗКИ количество липид-ных капель сокращается до 1-3-х с расположением их на противоположных полюсах клетки (рисунок 5).

Активированные ЗКИ приобретают вытянутую форму, значительные участки цитоплазмы занимает комплекс Гольджи, выявляются довольно многочисленные цистерны ГрЭС (показатель синтеза белка на экспорт). Количество остальных органелл снижено: обнаруживаются малочисленные свободные рибосомы и полисомы, единичные митохондрии, нерегулярно - ли-зосомы (рисунок 6).

В 2007 г. ЗКИ были впервые названы стволовыми клетками печени, так как они экспресси-руют один из маркеров кроветворных мезенхи-мальных стволовых клеток - CD133 .

Рисунок 5. - ЗКИ, находящиеся в активированном состоянии

а, б - ЗКИ (синие стрелки) с единичными липидными включениями, локализованными у противоположных полюсов ядра. Перисинусоидальная соединительная ткань (на рис. 6а) и прослойка межклеточного матрикса вокруг гепатоцита (на рис. 6б) окрашены в красный цвет. Цитотоксические лимфоциты (фиолетовые стрелки). Эндотелиальная клетка (белая стрелка). Тесный контакт плазматической клетки (красная стрелка) и гепатоцита. Полутонкие срезы. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотографии. Увел. 1000 ; в, г - ультраструктурные компоненты ЗКИ: митохондрии (оранжевые стрелки), комплекс Гольджи (красная стрелка), цистерны его более осмиофильной цис-стороны обращены к расширенным элементам гранулярной эндоплазматической сети (зеленые стрелки), лизосома (голубая стрелка) (ув. 10 000 и 20 000, соответственно); в, г - электронограммы

Миофибробласты, которые отсутствуют в нормальной печени, имеют три потенциальных источника: первый - во время внутриутробного развития печени, в портальных трактах миофибробласты окружают сосуды и желчные протоки во время их созревания, а после полного развития печени они исчезают и заменяются в портальных трактах портальными фибробластами; второй - при поражении печени они образуются за счет портальных мезенхимальных клеток и покоящихся ЗКИ, реже за счет переходных эпителиально-мезенхимальных клеток. Они характеризуются наличием CD45-, CD34-, Desmin +, глиального фибриллярного белка, ассоциированного с (GFAP) + и Thy-1 +.

Недавние исследования показали, что гепа-тоциты, холангиоциты и эндотелиальные клетки могут стать миофибробластами через эпителиальные или через переход эндотелиальных клеток в мезенхимальные (EMT). Эти клетки включают такие маркеры, как CD45-, альбумин+ (т.е. гепатоцитов), CD45-, CK19+ (т.е. холанги-оцитов) или Tie-2 + (эндотелиальные клетки).

Рисунок 6. - Высокая фибротическая активность ЗКИ

а, б - миофибробласт (Мфб), клетка содержит крупное ядро, элементы ГрЭС (красные стрелки), многочисленные свободные рибосомы, полиморфные везикулы и гранулы, единичные митохондрии и яркий визуализационный признак - пучок актиновых нитей в цитоплазме (желтые стрелки); увел. 12 000 и 40 000; в, г, д, е - высокая фибротическая активность ЗКИ при сохранении в цитоплазме ретиноидсодержащих липидных капель. Многочисленные пучки коллагеновых фибрилл (белые стрелки), сохранивших (а) и потерявших (г, д, е) специфическую поперечную исчерченность; увел. 25 000, 15 000, 8 000, 15 000. Электронограммы

Кроме того, клетки костного мозга, состоящие из фиброцитов и циркулирующих мезенхим-ных клеток, могут трансформироваться в миофибробласты. Это клетки CD45+ (фиброциты), CD45+/- (циркулирующие мезенхимальные клетки), коллаген типа 1+, CD11d+ и МНС класса 11+ (рисунок 7) .

Литературные данные подтверждают не только тесную связь пролиферации овальных клеток с пролиферацией синусоидальных клеток , но и данные о возможной дифференцировке ЗКИ в печеночный эпителий , которая была названа мезенхимально-эпителиальной трансформацией перисинусоидальных клеток .

В состоянии фиброгенной активации миофи-бробластоподобные ЗКИ, наряду с уменьшением числа и последующим исчезновением липидных капель, характеризуются очаговой пролиферацией (рисунок 8), иммуногистохимической экспрессией фибробластоподобных маркеров, в том числе гладкомышечного а-актина, и формированием перицеллюлярных коллагеновых фибрилл в пространствах Диссе .

В фазу развития фиброза нарастающая гипоксия печеночной ткани становится фактором дополнительной избыточной экспрессии в стволовых клетках провоспалительных молекул адгезии - 1САМ-1, 1САМ-2, VEGF, провоспа-

Взаимодействие протоковых печеночных клеток-предшественников с миофибробластами печени

Миофибробластоподобные ЗКИ в состоянии фиброгенной активации .

Рисунок 7. - Участники миофибробластической активации ЗКИ

лительных хемоаттрактантов - M-CSF, МСР-1 (моноцитарный хемотаксический протеин-1) и СЖС (цитокин-обусловленный нейтрофильный хемоаттрактант) и других, которые стимулируют образование провоспалительных цитокинов (TGF-b, PDGF, FGF, PAF, SCF, ЕТ-1) и усиливают процессы фиброгенеза в печени, создавая условия для самоподдерживаемой индукции непрекращающейся активации ЗКИ и процессов фиброгенеза .

На микроскопических препаратах перикапил-лярный фиброз проявляется в виде интенсивной окраски перисинусоидальной соединительной ткани и прослойки межклеточного матрикса вокруг гепатоцитов (часто гибнущих) в красный цвет. На электронно-микроскопических препаратах фиброзные изменения визуализируются либо в виде сформированных крупных пучков фибрилл коллагеновых волокон, сохранивших поперечную исчерченность, либо в виде массив-

ных отложений в пространстве Диссе волокнистой массы, представляющей собой набухшие и потерявшие периодическую исчерченность кол-лагеновые волокна (рисунок 9).

По современным представлениям, фиброз -динамический процесс, который может прогрессировать и регрессировать (рисунок 10).

В последнее время были предложены несколько специфических маркеров ЗКИ: расцвет витамина А (ВА) в липидные капли, GFAP, рецептор р75 NGF и синаптофизин . Проводятся исследования по участию ЗКИ печени в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток печени .

Нами исследовано содержание ретинолсвя-зывающего белка (РСБ-4), образующего комплекс с ВА, концентрация которого в плазме крови в норме коррелирует с обеспеченностью организма ВА, 80% которого находится в ЗКИ.

Установлена зависимость между содержани-

Рисунок 8. - Очаговая пролиферация ЗКИ в состоянии фиброгенной активации

а - гиперплазия ЗКИ (белые стрелки) в просвете расширенных синусоидов; б - пролиферация трансдифференцированных ЗКИ (белые стрелки), эндотелиальная клетка (розовая стрелка). Полутонкие срезы. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотографии. Увел. 1000

Рисунок 9. - Финальная стадия миофибробластиче-ской активации ЗКИ

а, б - перисинусоидальный фиброз (белые стрелки). Пери-синусоидальная соединительная ткань и прослойка межклеточного матрикса вокруг гепатоцитов (б) окрашены основным фуксином в красный цвет. ЗКИ, активированные и трансформированные в фибробласты (синие стрелки). Гц на рис. а - гепатоцит с опустошенной цитоплазмой. Полутонкие срезы. Окраска азур II - основной фуксин. Микрофотографии. Увел. 1000; в, г - перисинусоидальный и перигепатоцеллюлярный фиброз в дольке печени, повышенная электронная плотность фибрилл коллагеновых волокон; конденсация матрикса митохондрий в гепатоците (оранжевая стрелка). Ув.8 000 и 15 000, соответственно. Электронограммы

Таблица 1. - Показатели содержания РСБ-4 у пациентов с циррозом печени (ЦП) и хроническим гепатитом (ХГ) разной этиологии, нг/мл (М±т)

Группа n M±m р

Цирроз печени 17 23,6±2,29 <0,05

ХГ, АсАТ норма 16 36,9±2,05* >0,05

ХГ, АсАТ >2-х норм 13 33,0±3,04* >0,05

ХГ, АлАТ норма 13 37,5±3,02* >0,05

ХГ, АлАТ >2-х норм 21 35,9±2,25* >0,05

Контроль 15 31,2±2,82

Примечание: р - достоверные различия с контролем (р<0,05); * - достоверные различия между ЦП и ХГ (р<0,05)

Ложная долька, окруженная фи- Резолюция фиброзной септы во-брозной септой. Окраска по Массо- круг ложной дольки. Окраска по ну.Ув.х50 Массону. Ув.х200

Рисунок 10. - Динамика событий в ложной дольке пациента с вирусным циррозом печени через 6 месяцев после трансплантации в печень аутологичных мезенхимальных стволовых клеток

ем РСБ-4 и 4-й стадией фиброза (цирроз) в отличие от хронического гепатита, при котором такая зависимость не прослеживалась, независимо от биохимических маркеров активности воспаления в печени.

Данный факт необходимо учитывать при обосновании заместительной терапии для устранения дефицита ВА в организме, который может быть обусловлен истощением потенциала ЗКИ, обусловленного прогрессированием фиброза в печени.

1. Максимальная результативность оценки структурно-функционального состояния ЗКИ обеспечивается морфологическим исследованием прижизненного биоптата при одновременном использовании комплекса методик клеточной визуализации (световая, электронная микроскопия ультратонких срезов и оригинальных методов фиксации и окраски).

2. Результаты морфологического исследования ЗКИ позволяют повысить качество прижизненной диагностики фиброза, провести его мониторинг и прогнозирование исходов хронических диффузных поражений печени на более высоком современном уровне.

3. Результаты морфологических заключений позволят клиницисту дополнительно включить в формулировку окончательного диагноза уточненные данные по стадии хронизации (стабилизация, прогрессирование или резолюция фиброза) в процессе терапии.

Литература

1. Ивашкин, В. Т. Клиническая симптоматика дофибро-тических изменений: стенограмма лекции Всероссийского Интернет-Конгресса специалистов по внутренним болезням / В. Т. Ивашкин, А. О. Буеверов // ИНТЕРНИСТ: Национальное Интернет-Общество специалистов по внутренним болезням. - 2013. - Режим доступа: http://internist. ru/publications /detail/6569/. - Дата доступа: 21.11.2016.

2. Киясов, А. П. Овальные клетки - предполагаемые стволовые клетки печени или гепатобласты? / А. П. Киясов, А. А. Гумерова, М. А. Титова // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. - Т. 2, № 4. - С. 55-58.

1. Ivashkin, V. T. Klinicheskaya simptomatika dofibroticheskih izmenenij: stenogramma lekcii Vserossijskogo Internet-Kongressa specialistov po vnutrennim boleznyam / V. T. Ivashkin, A. O. Bueverov // INTERNIST: Nacional"noe Internet-Obshchestvo specialistov po vnutrennim boleznyam. - 2013. - Rezhim dostupa: http://internist.ru/publications / detail/6569/. - Data dostupa: 21.11.2016.

2. Kiyasov, A. P. Oval"nye kletki - predpolagaemye stvolovye kletki pecheni ili gepatoblasty? / A. P. Kiyasov, A. A. Gumerova, M. A. Titova // Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya. - 2006. - T. 2, № 4. - S. 55-58.

3. О роли синусоидальных клеток печени и клеток костного мозга в обеспечении регенераторной стратегии здоровой и поврежденной печени / А. В. Люндуп [и др.] // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2010. - Т. XII, № 1. - С. 78-85.

4. Серов, В. В. Морфологические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии процесса при вирусных хронических гепатитах В и С / В. В. Серов, Л. О. Севергина // Архив патологии. - 1996. - № 4. - С. 61-64.

5. Структурно-функциональная характеристика звездчатых клеток печени в динамике фиброза / О. А. Постникова [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 10.

6. Ультраструктурное и иммуногистохимическое исследование звездчатых клеток печени в динамике фиброза и цирроза печени инфекционно-вирусного генеза / Г. И. Непомнящих [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 142, № 12. - С. 681-686.

7. Щеглев, А. И. Структурно-метаболическая характеристика синусоидальных клеток печени / А. И. Щеглев, О. Д. Мишнев // Успехи современной биологии. - 1991. - Т. 3, № 1. - С. 73-82.

10. Effects of dietary retinoid and triglyceride on the lipid composition of rat liver stellate cells and stellate cell lipid droplets / H. Moriwaki // J. Lipid. Res. - 1988. - Vol. 29. - Р. 1523-1534.

13. Friedman, S. Hepatic fibrosis 2006: Report of the Third AASLD Single Topic Conference / S. Friedman, D. Rockey, B. Montgomery // Hepatology. - 2006. - Vol. 45 (1). - Р. 242-249.

18. Iredale, J. P. Hepatic Stellate Cell Behavior During Resolution of Liver Injury / J. P. Iredale // Semin. Liver Dis. -2001. - Vol. 21 (3). - Р. 427-436.

19. Kobold, D. Expression of reelin in hepatic stellate cells and during hepatic tissue repair: a novel marker for the differentiation of HSC from other liver myofibroblasts / D. Kobold // J. Hepatol. - 2002. - Vol. 36 (5). - Р. 607-613.

20. Lepreux, S. Human liver myofibroblasts during development and diseases with a focus on portal (myo)

3. O roli sinusoidal"nyh kletok pecheni i kletok kostnogo mozga v obespechenii regeneratornoj strategii zdorovoj i povrezhdennoj pecheni / A. V. Lyundup // Vestnik transplantologii i iskusstvennyh organov. - 2010. - T. HII, № 1. - S. 78-85.

4. Serov, V. V. Morfologicheskie kriterii ocenki ehtiologii, stepeni aktivnosti i stadii processa pri virusnyh hronicheskih gepatitah V i S / V. V. Serov, L. O. Severgina // Arhiv patologii.

1996. - № 4. - S. 61-64.

5. Strukturno-funkcional"naya harakteristika zvezdchatyh kletok pecheni v dinamike fibroza / O. A. Postnikova // Fundamental"nye issledovaniya. - 2011. - № 10. - C. 359-362.

6. Ul"trastrukturnoe i immunogistohimicheskoe issledovanie zvezdchatyh kletok pecheni v dinamike fibroza i cirroza pecheni infekcionno-virusnogo geneza / G. I. Nepomnyashchih // Byulleten" ehksperimental"noj biologii i mediciny. - 2006. - T. 142, № 12. - S. 681-686.

7. SHCHeglev, A. I. Strukturno-metabolicheskaya harakteristika sinusoidal"nyh kletok pecheni / A. I. SHCHeglev, O. D. Mishnev // Uspekhi sovremennoj biologii. - 1991. - T. 3, № 1. - S. 73-82.

8. CD34 hepatic stellate cells are progenitor cells / C. Kordes // Biochem., Biophys. Res. Common. - 2007. -Vol. 352 (2). - P. 410-417.

9. Degradation of matrix proteins in liver fibrosis / M. J. Arthur // Pathol. Res. Pract. - 1994. - Vol. 190 (9-10).

11. Fetal liver consists of cells in epithelial-to-mesenchymal transition / J. Chagraoni // Blood. - 2003. - Vol. 101. - P. 2973-2982.

12. Fixation, degydratation and embedding of biological specimens / A. M. Glauert // Practical Methods in Electron Microscopy. - New York: Am. Elsevier, 1975. - Vol. 3, part 1.

13. Friedman, S. Hepatic fibrosis 2006: Report of the Third AASLD Single Topic Conference / S. Friedman, D. Rockey, B. Montgomery // Hepatology. - 2006. - Vol. 45 (1). - R. 242-249.

14. Gaga, M. D. Human and rathepatic stellate cells produce stem cell factor: a possible mechanism for mast cell recruitment in liver fibrosis / M. D. Gaga // J. Hepatol. - 1999. - Vol. 30, № 5. - P. 850-858.

15. Glauert, A. M. Araldite as embedding medium for electron microscopy / A. M. Glauert, R. H. Glauert // J. Biophys. Biochem. Cytol. - 1958. - Vol. 4. - P. 409-414.

16. Hepatic stellate cells and portal fibroblasts are the major cellular sources of collagens and lysyl oxidases in normal liver and early after injury / M. Perepelyuk // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. - 2013. - Vol. 304 (6). - P. 605614.

17. Hepatitis C virus core and nonstructural proteins induce fibrogenic effects in hepatic stellate cells / R. Bataller // Gastroenterology. - 2004. - Vol. 126, iss. 2. - P. 529-540.

18. Iredale, J. P. Hepatic Stellate Cell Behavior During Resolution of Liver Injury / J. P. Iredale // Semin. Liver Dis. -2001. - Vol. 21 (3). - R. 427-436.

20. Lepreux, S. Human liver myofibroblasts during development and diseases with a focus on portal (myo) fibroblasts / S. Lepreux, A. Desmouliére

fibroblasts / S. Lepreux, A. Desmouliere // Front. Physiol. - 2015. - Mode of access: http://dx.doi. org/10.3389/fphys.2015.00173. - Date of access: 31.10.2016.

22. Mesenchymal Bone Marrow-derived Stem Cells Transplantation in Patients with HCV Related Liver Cirrhosis / S. Lukashyk // J. Clin. Transl. Hepatol. - 2014. - Vol. 2, iss. 4. - P. 217-221.

23. Millonig, G. A. Advantages of a phosphate buffer for osmium tetroxide solutions in fixation / G. A. Millonig // J. Appl. Physics. - 1961. - Vol. 32. - P. 1637-1643.

Vol. 158. - P. 1313-1323.

Vol. 24. - P. 205-224.

29. Querner, F. Der mikroskopische Nachweis von Vitamin Aimanimalen Gewebe. Zur Kenntnis der paraplasmatischen Leberzellen-einschlüsse. Dritte Mitteilung / F. Querner // Klin. Wschr. - 1935. - Vol. 14. - P. 1213-1217.

30. Recent developments in myofibroblast biology: paradigms for connective tissue remodeling / B. Hinz // Am. J. Pathol. - 2012. - Vol. 180. - P. 1340-1355.

35. Septum transversum-derived mesothelium gives rise to hepatic stellate cells and perivascular mesenchymal cells in developing mouse liver / K. Asahina // Hepatology. -2011. - Vol. 53. - P. 983-995.

Vol. 50. - P. 66-71.

38. Thabut, D. Intrahepatic angiogenesis and sinusoidal remodeling in chronic liver disease: new targets for the treatment of portal hypertension? / D. Thabut, V. Shah // J. Hepatol. - 2010. - Vol. 53. - P. 976-980.

39. Wake, K. Hepatic stellate cells: Three-dimensional structure, localization, heterogeneity and development / K.

// Front. Physiol. - 2015. - Mode of access: http://dx.doi. org/10.3389/fphys.2015.00173. - Date of access: 31.10.2016.

21. Ligands of peroxisome proliferator-activated receptor gamma mod-ulateprofibrogenic and proinflammatory actions in hepatic stellate cells / F. Marra // Gastroenterology. -2000. - Vol. 119. - P. 466-478.

22. Mesenchymal Bone Marrow-derived Stem Cells Transplantation in Patients with HCV Related Liver Cirrhosis / S. Lukashyk // J. Clin. Transl. Hepatol. - 2014. - Vol. 2, iss. 4. - R. 217-221.

23. Millonig, G. A. Advantages of a phosphate buffer for osmium tetroxide solutions in fixation / G. A. Millonig // J. Appl. Rhysics. - 1961. - Vol. 32. - P. 1637-1643.

24. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver / S. Paku // Am. J. Hepatol. - 2001.

Vol. 158. - P. 1313-1323.

25. Origin of myofibroblasts in liver fibrosis / D. A. Brenner // Fibrogenesis Tissue Repair. - 2012. - Vol. 5, suppl. 1. - S. 17.

26. Origins and functions of liver myofibroblasts / S. Lemoinne // Biochim. Biophys. Acta. - 2013. - Vol. 1832 (7). - P. 948-954.

27. Pinzani, M. PDGF and signal transduction in hepatic stellate cells / M. Pinzani // Front. Biosci. - 2002. - Vol. 7. - P. 1720-1726.

28. Popper, H. Distribution of vitamin A in tissue as revealed by fluorescence microscopy / H. Popper // Physiol. Rev. - 1944.

Vol. 24. - R. 205-224.

30. Recent developments in myofibroblast biology: paradigms for connective tissue remodeling / B. Hinz // Am. J. Pathol. - 2012. - Vol. 180. - R. 1340-1355.

31. Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy / E. S. Reynolds // J. Cell. Biol. - 1963. - Vol. 17. - P. 208-212.

32. Safadi, R. Immune stimulation of hepatic fibrogenesis by CD8 cells and attenuation by transgenic interleukin-10 from hepatocytes / R. Safadi // Gastroenterology. - 2004. - Vol. 127 (3). - P. 870-882.

33. Sato, T. An electron microscopic study of specimen-fixed for longer periods in phosphate buffered formalin / T. Sato, I. Takagi // J. Electron Microsc. - 1982. - Vol. 31, № 4. - P. 423-428.

34. Senoo, H. Vitamin A-Storing Cells (Stellate Cells) / H. Senoo, N. Kojima, M. Sato // Vitam. Horm. - 2007. - Vol. 75.

36. Stanciu, A. New data about ITO cells / A. Stanciu, C. Cotutiu, C. Amalinei // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi. -2002. - Vol. 107, № 2. - P. 235-239.

37. Suematsu, M. Professor Toshio Ito: a clairvoyant in pericyte biology / M. Suematsu, S. Aiso // Keio J. Med. - 2000.

Vol. 50. - R. 66-71.

39. Wake, K. Hepatic stellate cells: Three-dimensional structure, localization, heterogeneity and development / K. Wake // Proc. Jpn. Acad. Ser. B, Phys. Biol. Sci. - 2006. - Vol.

Wake // Proc. Jpn. Acad. Ser. B, Phys. Biol. Sci. - 2006. - Vol. 82 (4). - P. 155-164.

82 (4). - P. 155-164.

40. Wake, K. In Cells of the Hepatic Sinusoid / K. Wake, H. Senoo // Kupffer Cell Foundation (Rijswijk, The Netherlands). - 1986. - Vol. 1. - P. 215-220.

41. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals / M. L. Watson // J. Biophys. Biochem. Cyt. - 1958. - Vol. 4. - P. 475-478.

CLINICAL CYTOLOGY OF THE LIVER: ITO STELLATE CELLS (HEPATIC STELLATE CELLS)

Tsyrkunov V. M, Andreev V. P., Kravchuk R. I., Kandratovich I. A. Educational Establishment "Grodno State Medical University", Grodno, Belarus

The aim of the work is to present the structural and functional characteristic of HSC based on the findings of cytological identification of intravital liver biopsy samples.

Materials and methods. Classical methods of light and electron microscopy of biopsy samples within the original technique of using ultrathin sections, fixation and staining were applied.

Results. The structural characteristics of the HSC of the liver biopsy samples from patients with chronic hepatitis C are presented on photo illustrations of light and electron microscopy. HSC are depicted at different stages (rest, activation) and during the process of transformation into myofibroblasts.

Conclusions. The use of original methods of clinical and morphological identification and evaluation of the functional status of HSC allows to improve the quality of diagnosis and prognosis of liver fibrosis.

Последние материалы сайта

Наследственные

«Прекрасный фонтан» на центральной площади Нюрнберга

2024-03-18 02:17:10

Фотографии Антона Дергачева (кроме первой), комментарий Владимира Дергачева Идеальная супружеская пара на лебедях, которая вот-вот поцелуются. Фонтан «Супружеская или Брачная карусель» создан по мотивам немецкого средневекового поэта и композитора Ганс

Симптомы

Карта-схема комплексного обследования

2024-03-17 02:20:11

Логопедическое обследование детей с церебральным параличом Логопедическое обследование детей, страдающих церебральным параличом, строится на общем системном подходе, который опирается на представление о речи как о сложной функциональной системе, структ

Методы диагностики

Пять компотов из вишни на зиму

2024-03-16 02:52:10

Александр Гущин За вкус не ручаюсь, а горячо будет:) Содержание Яркая, красивая ягода вишня содержит в себе огромное количество полезных микроэлементов и витаминов. Ее универсальность в кулинарии позволяет приготовить массу хороших, вкусных, уникаль

Болевые синдромы

Готовим изумительную пшенную кашу на молоке в мультиварке редмонд Как сварить пшенную кашу скороварке

2024-03-14 02:19:07

Ни одна кастрюля в мире не сварит пшенную кашу на молоке так вкусно, как это сделает мультиварка. И ни одна плита не справится с ее приготовлением так быстро, как мультиварка-скороварка. Простой и здоровый завтрак – сладкая пшенная каша на молоке, сдобрен

Синдромы

Рыцарь монет таро значение в отношениях

2024-03-09 02:51:07

Название: Рыцарь пентаклей, Рыцарь денариев, Рыцарь монет, Воин монет, Рыцарь бубен, Путешественник, Завоеватель Дел, Всадник, Кавалер, Полезный человек, Повелитель Земель Диких и Плодородных. Значение по Папюсу: Выгода, Прибыль, Польза, Интерес. Важное

Методы лечения

Гороскоп на август телец девушка